綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的初步建立

劉 月，張宇飛，孫曉林，劉淑英，2*

(1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室，呼和浩特 010018)

綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的初步建立

劉 月1，張宇飛1，孫曉林1，劉淑英1，2*

(1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室，呼和浩特 010018)

為制備抗綿羊肺腺瘤病毒(JSRV)囊膜蛋白(ENV)胞質(zhì)尾區(qū)(CT)的單克隆抗體，利用生物信息學(xué)分析JSRV囊膜蛋白氨基酸序列，根據(jù)分析結(jié)果合成多肽，將此多肽分別連接鑰孔血藍蛋白(CT-KLH)和牛血清白蛋白(CT-BSA)，用CT-KLH作為抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合。建立間接ELISA方法篩選分泌抗CT蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗CT蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為8E5，亞類為 IgG2a/κ。間接ELISA檢測培養(yǎng)上清效價為6.4×103，腹水效價為1×105。Western blot及免疫組化結(jié)果顯示，這株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體能識別JSRV抗原，與其發(fā)生特異性反應(yīng)。試驗結(jié)果證明，單抗8E5是綿羊肺腺瘤的重要診斷試劑。應(yīng)用8E5細胞株分泌的單克隆抗體建立JSRV-ENV的雙抗體夾心ELISA檢測方法，該ELISA檢測方法特異性、重復(fù)性和敏感性良好，為快速檢測診斷綿羊肺腺瘤和研究囊膜蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

綿羊肺腺瘤病毒；囊膜蛋白；B細胞表位；單克隆抗體；ELISA

綿羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)是綿羊肺腺瘤(ovine pulmonary adenocarcinoma，OPA)的病原，該病毒主要侵害綿羊肺[1-3]。JSRV 屬于β-反轉(zhuǎn)錄病毒屬，基因組為線性單股正鏈RNA，JSRV全長7 462～7 580 bp，編碼4個相互重疊的基因5′-gag-pro-pol-env-3′，其中env基因編碼位于病毒外層的囊膜蛋白，包括表面蛋白(SU)和跨膜蛋白(TM)，這些病毒蛋白質(zhì)首先是以大的前體蛋白的形式被表達出來，之后經(jīng)過裂解形成成熟的病毒蛋白質(zhì)[4-6]。

綿羊肺腺瘤病毒在20 ℃時存活6周，80 ℃ 20 min以上才能使病毒滅活，潛伏期2～4年，病死率為100%[7]，JSRV的環(huán)境耐受性和較長的潛伏期使得OPA的控制較為困難，所以早期的診斷有利于綿羊肺腺瘤的控制。在綿羊的基因組中存在與外源性綿羊肺腺瘤病毒(ex-JSRV)高同源性(90%以上)的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒(en-JSRV)[8-9]，導(dǎo)致綿羊肺腺瘤病羊體內(nèi)未曾檢測到JSRV的循環(huán)抗體，ex-JSRV可誘導(dǎo)機體的細胞免疫，但不能誘導(dǎo)B細胞分泌對應(yīng)的抗體進行體液免疫[10]，不能用常規(guī)的血清學(xué)方法進行診斷，因此特異性抗原的檢測是診斷OPA的有效方法。en-JSRV與ex-JSRV主要的兩個高變區(qū)分別位于囊膜蛋白(ENV)的跨膜蛋白(TM)亞基的胞質(zhì)尾區(qū)(CT，即ENV編碼區(qū)的第570—615位氨基酸)和長末端重復(fù)序列(LTR)的U3區(qū)[11-12]，而LTR的U3 區(qū)是非編碼區(qū)，不編碼蛋白質(zhì)，所以制備特異性的抗胞質(zhì)尾區(qū)的單克隆抗體用于檢測exJSRV抗原十分重要。由于en-JSRV與ex-JSRV 之間具有很高的同源性，采用常規(guī)的單抗制備方法很難制取特異性強的單克隆抗體，為了制備抗ex-JSRV蛋白的特異性單克隆抗體，作者從NCBI 數(shù)據(jù)庫中搜索ex-JSRV 囊膜蛋白氨基酸序列，以本實驗室登錄到GenBank中的JSRV-NM株env基因序列(登錄號：JQ837489)為模板翻譯ex-JSRV囊膜蛋白氨基酸序列，根據(jù)SOPMA、Bcepred和ABCpred分別對ex-JSRV 囊膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、柔韌性、暴露表面、極性和抗原性分析的結(jié)果選定ex-JSTV特異性肽段進行人工合成，制備特異性抗ex-JSRV的單克隆抗體，并應(yīng)用單克隆抗體建立了JSRV-ENV的雙抗體夾心ELISA檢測方法，為快速檢測診斷綿羊肺腺瘤和研究囊膜蛋白功能積累資料。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

純系6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華公司。小鼠骨髓瘤細胞系(Sp2/0)購自昆明細胞中心。

1.2 主要試劑

跨膜蛋白亞基胞質(zhì)尾區(qū)特異性多肽由杭州中肽生物有限公司合成。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司。HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、聚乙二醇(PEG1450)、谷氨酰胺、完全福氏佐劑、不完全福氏佐劑均購自Sigma公司。檢測小鼠單克隆抗體免疫球蛋白亞類的試劑盒購自Thermo公司。HRP-羊抗鼠IgG購自艾美杰公司。免疫組化二抗及顯色試劑購自福建邁新公司，全蛋白提取試劑盒購自上海生工。其他常規(guī)用試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 單克隆抗體的制備

1.3.1 綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白胞質(zhì)尾區(qū)的生物信息分析與合成 通過生物信息學(xué)分析JSRV-NM囊膜蛋白的氨基酸序列(來自GenBank，序列登錄號為JQ837489)。SOPMA(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)軟件分析該區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)，Bcepred(http：//www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred_submission.html)軟件分析親水性、表面可及性、柔韌性、暴露表面、極性和抗原傾向性。ABCpred(http：//www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)預(yù)測抗原性。根據(jù)預(yù)測結(jié)果合成多肽，并分別與鑰孔血藍蛋白和牛血清白蛋白連接。

1.3.3 動物免疫及雜交瘤細胞株的篩選克隆 以合成的CT-KLH多肽按常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，脾淋巴細胞與SP2/0細胞以1∶10比例混合后用PEG1450融合。用間接ELISA檢測陽性克隆，經(jīng)有限稀釋法亞克隆獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞。

1.3.4 單克隆抗體腹水制備與效價測定 選取8～10周齡的BABL/c雌鼠按常規(guī)方法制備腹水。采用間接 ELISA 法測定單克隆抗體的效價，以SP2/0細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，以陽性反應(yīng)樣品的最高稀釋倍數(shù)作為其效價。

1.3.5 單克隆抗體亞類鑒定及抗體分泌穩(wěn)定性鑒定 按說明書稀釋羊抗鼠各類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA) 和亞類( IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)包被酶標板，以HRP標記的羊抗鼠各類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)和亞類(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3) 抗體分別為二抗，取陽性細胞上清液檢測，鑒定McAb 的類和亞類。將雜交瘤細胞系持續(xù)培養(yǎng)30代，測定F5、F10、F15、F20、F30代細胞上清OD450 nm值。

1.3.6 單克隆抗體Western blot和免疫組織化學(xué)鑒定 提取由本實驗室保存的JSRV感染羊病肺組織的蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，以雜交瘤細胞上清為一抗，用HRP標記羊抗鼠IgG抗體作為二抗，進行免疫印跡檢測[13]。用本實驗室保存的自然感染JSRV的羊肺組織制備石蠟切片進行免疫組化檢測。

1.4 夾心ELISA檢測方法的建立及評價

1.4.1 包被用多克隆抗體和檢測用單克隆抗體稀釋度的確定 將純化的多克隆抗體(本實驗室制備)分別1∶200、1∶300、1∶600和1∶1 200連續(xù)稀釋6個稀釋度，每個稀釋度重復(fù)2孔，4 ℃包被酶標板反應(yīng)過夜。將自制HRP標記的鼠單克隆抗體分別1∶200、1∶300、1∶600和1∶1 200倍比稀釋，每個稀釋度2重復(fù)孔，組成方陣確定多克隆抗體的最佳包被濃度和單克隆抗體的最佳檢測稀釋度。

1.4.2 最佳反應(yīng)條件與陰陽性臨界值的確定 用多抗和單抗的最佳稀釋度，在不同反應(yīng)條件下，對包被條件(37 ℃包被2 h加4 ℃過夜、37 ℃包被2 h和 4 ℃過夜)、封閉液種類(10%和5%胎牛血清，10%和5%BSA，10%和5%脫脂乳)、封閉時間(30、60、90、120 min)、檢測樣品孵育時間(30、60、90、120 min)、底物(TMB)孵育時間(10、15、20、30 min)進行篩選，以JSRV病肺組織提取蛋白質(zhì)和正常肺組織提取蛋白質(zhì)為檢測樣品進行ELISA試驗，測定OD450 nm值，計算出P/N值，以確定最佳反應(yīng)條件。

1.4.3 特異性試驗 按照已經(jīng)確立的雙抗體夾心ELISA操作程序，分別檢測羊的主要常見疫病(羊布病、口蹄疫、小反芻獸疫、羊痘、羊快疫、羊猝狙、羊黑疫和羊腸毒血病)的疫苗與制備的抗體有無交叉反應(yīng)。羊布病疫苗(S2株)購自齊魯制藥，羊口蹄疫三聯(lián)苗(包括亞Ⅰ型-JSL/ZK/06株、O型-O/MYA98/BY/2010株、A型-WH109株)購自金宇制藥，小反芻獸疫疫苗(Nigeria75/1株) 購自天康生物，羊痘疫苗(弱毒株)和羊梭菌三聯(lián)四防疫苗(腐敗型梭菌，B、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌)購自中牧集團。

1.4.4 敏感性試驗 將JSRV病肺組織提取蛋白質(zhì)以1∶10、1∶50、1∶100、1∶200倍比稀釋，按上述最佳反應(yīng)條件進行雙抗體夾心ELISA試驗。確定該方法的最低檢出濃度。

1.4.5 重復(fù)性 取4塊不同批次包被的酶標板(20140826、20140827、20140828、20140829)，計算批間變異系數(shù)CV=(s/OD450nm平均值)×100%；在同一塊酶標板上進行批內(nèi)重復(fù)，計算批內(nèi)變異系數(shù)。

2 結(jié) 果

作者從生物信息學(xué)(圖1)、組織學(xué)(圖2)和免疫學(xué)等方面進行了研究。

2.1 生物信息分析結(jié)果

利用生物信息學(xué)分析綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白氨基酸，分析胞質(zhì)尾區(qū)特性，結(jié)果顯示SOPMA 軟件分析該區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)以β折疊、無規(guī)則卷曲和α螺旋構(gòu)成(圖1)，Bcepred軟件分析結(jié)果：親水性(604—615 KNKERGDAGDDP)；表面可及性(576—582 RDFLKMR，568—597 LHMKYRNMLQHQ，600—613 MELLKNKERGDAGD)；柔韌性(600—609 MELLKNKERG)；極性(604—607 KNKE)；暴露面(576—593 RDFLKMRVEMLHMKYRNM，595—614 QHQHLMELLKNKERGDAGDD)抗原傾向性(550—575 LLGLGILVFIIIVVILIFPCLVRGMV)。ABCpred 預(yù)測抗原表位評分結(jié)果：第600—615、572—587、581—596位氨基酸評分分別是0.95、0.83、0.74。說明JSRV囊膜蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)存在抗原優(yōu)勢區(qū)。根據(jù)分析結(jié)果合成囊膜蛋白氨基酸序列第572—615位氨基酸(RGMVRDFLKMRVEMLHMKYRNMLQHQHLMELLKN-KERGDAGDDP)，圖1中矩形框內(nèi)區(qū)域。

不同的顏色代表不同的二級結(jié)構(gòu)：藍色，α螺旋；綠色，β轉(zhuǎn)角；紅色，β折疊；黃色，無規(guī)則卷曲Lines in different colors represent different secondary structures：Blue，α helix；green，β turn；red，extended strand；and yellow，random coil圖1 JSRV囊膜蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Secondary structure prediction results for the JSRV-ENV

A.腫瘤肺組織免疫組化，100×；B.腫瘤肺組織免疫組化，200×；C.腫瘤肺組織免疫組化400×；D.HE染色，200×A.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining，100×；B.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining，200×；C.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining，400×；D.HE staining，200×圖2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果Fig.2 Result of ovine pulmonary adenocarcinoma

2.2 間接ELISA檢測方法的建立

抗原的稀釋質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1，血清稀釋度為1∶200時，陰性與陽性血清的OD450 nm的比值相差最大(P/N=6.442)。建立篩選CT蛋白單克隆抗體的間接ELISA方法。陽性判斷標準為待檢血清OD450 nm>0.143，陰性判斷標準為待檢血清OD450 nm<0.128，之間為可疑。

2.3 雜交瘤細胞株的篩選與腹水效價測定

間接ELISA篩選融合后的細胞，獲得1株高效分泌抗CT蛋白抗體的雜交瘤細胞株，命名為8E5。間接ELISA檢測培養(yǎng)上清效價為6.4×103，腹水效價為1×105。

2.4 單克隆抗體的亞類和穩(wěn)定性鑒定

按照試劑盒說明書進行試驗，結(jié)果表明8E5屬IgG2a/κ。將8E5連續(xù)培養(yǎng)30代，檢測第F5、F10、F15、F20、F30代細胞培養(yǎng)上清的OD450 nm值穩(wěn)定在0.9、1.0、1.2、1.2、1.2，結(jié)果表明此細胞株在連續(xù)傳代中抗體分泌量變化不大，穩(wěn)定性較好。

2.5 單克隆抗體免疫組織化學(xué)和Western blot分析

8E5單抗與綿羊肺腺瘤病羊肺組織進行免疫組織化學(xué)檢測，主要在病變的腺瘤灶(箭頭處)處可見棕色陽性信號(圖2)，結(jié)果證明8E5單克隆抗體可與綿羊肺腺瘤病毒自然感染病例的病變肺組織發(fā)生陽性反應(yīng)，陽性信號主要在癌變的肺泡上皮細胞中的細胞質(zhì)內(nèi)，進一步證明8E5單克隆抗體可識別天然的綿羊肺腺瘤病毒的病毒粒子。

Western blot分析顯示在70～100 ku與35～40 ku之間分別各有一條棕色條帶，與綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的前體蛋白和跨膜蛋白(TM)大小相符[14]，證明8E5單克隆抗體可識別變性的綿羊肺腺瘤病原(圖3)。

1.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；2.陰性對照；3.JSRV病肺蛋白質(zhì)樣品1.Molecular weight marker；2.Negative control；3.Lung tissue proteins of JSRV infection圖3 圖 Western blot 檢測結(jié)果Fig.3 Result of Western blot

2.6 雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

最佳多抗包被稀釋度為1∶600(質(zhì)量濃度0.039 mg·mL-1)，最佳單抗檢測稀釋度為1∶300(質(zhì)量濃度0.012 mg·mL-1)；最佳包被條件為4 ℃過夜；最佳包被液為10%脫脂乳；最佳封閉時間為37 ℃ 60 min；最佳樣品檢測反應(yīng)時間為37 ℃ 60 min；最佳底物反應(yīng)時間為30 min。陰陽性臨界值的判定，大于0.143判定為陽性，小于0.128判定為陰性，兩者之間為可疑。

2.7 雙抗體夾心ELISA檢測方法的特異性試驗

按照已經(jīng)確立的雙抗體夾心ELISA操作程序，對羊的常見主要疫病病原進行檢測，結(jié)果表明各疫病的疫苗ELISA檢測結(jié)果為陰性，證明建立的夾心ELISA方法特異性良好。

2.8 雙抗體夾心ELISA檢測方法的敏感性和重復(fù)性試驗

該方法的最低檢出稀釋比例為1∶100，質(zhì)量濃度為0.034 mg·mL-1。本試驗建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法的批間與批內(nèi)重復(fù)性均小于10%，證明試驗建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法重復(fù)性良好。

3 討 論

Bcepred 是基于氨基酸的理化特性進行抗原性預(yù)測，ABCpred是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法進行預(yù)測，兩種方法的分析結(jié)果都表明綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)存在優(yōu)勢的抗原表位。第605—615位氨基酸的二級結(jié)構(gòu)為β折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，這種相對疏松的二級結(jié)構(gòu)有利于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合，抗原表位多出現(xiàn)在這種二級結(jié)構(gòu)分布的區(qū)域。

通常相對分子質(zhì)量小于10 ku的蛋白質(zhì)不能免疫動物使其產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，即沒有免疫原性，稱為半抗原。研究表明，有些短肽如果不進行交聯(lián)，往往無法單獨引發(fā)抗體的產(chǎn)生[15]。為了提高CT多肽的免疫原性，本研究中使用KLH和BSA交聯(lián)多肽。KLH由于其質(zhì)量大，復(fù)雜性高，與其他載體蛋白相比KLH會引出更強的免疫應(yīng)答，此蛋白質(zhì)來源于軟體動物，它在系統(tǒng)發(fā)展上遠離哺乳動物物種，在測定過程中產(chǎn)生會與非典型靶點樣品發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體的可能性較小。BSA具有很好的可溶性，適合做包被抗原。作為大分子BSA同樣也有免疫原性，但ELISA試驗所使用的封閉液多是來源于牛的脫脂乳和BSA，用連接BSA的多肽制備的抗體會影響試驗結(jié)果。

J.E.Henzy等[14]用抗跨膜蛋白(TM)的單克隆抗體做Western blot檢測結(jié)果與本試驗結(jié)果相符，可識別綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的前體蛋白和跨膜蛋白。用8E5單克隆抗體與自然感染綿羊肺腺瘤病毒的病羊肺組織進行免疫組織化學(xué)檢測的陽性信號主要分布在癌變的肺泡上皮細胞，與E.Beytut等[16]使用抗綿羊肺腺瘤病毒衣殼蛋白(JSRV-CA)多克隆抗體和C.Murgia等[17]使用抗綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白(JSRV-ENV)單克隆抗體做的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果相符，證明8E5單抗可以識別變性的和天然的綿羊肺腺瘤病毒的病毒粒子。

C.Summers等[10]用重組蛋白JSRV-CA和純化的病羊肺流出液分別免疫羊只能誘導(dǎo)T細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，引起細胞免疫，而不能誘導(dǎo)B細胞分泌特異性抗體進行體液免疫，這可能是因為胚胎期就表達的與外源性綿羊肺腺瘤病毒(ex-JSRV)高度同源性的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒(en-JSRV)影響所致[8]。跨膜蛋白(TM)的胞質(zhì)尾區(qū)(CT)是en-JSRV與ex-JSRV主要的高可變區(qū)，本試驗所用的缺失第570位的氨基酸的CT多肽連接鑰孔血藍蛋白(CT-KLH)，免疫BALB/c小鼠后，可誘導(dǎo)體液免疫，經(jīng)過4次免疫后血清效價達6.4×103，提示該肽段作為綿羊肺腺瘤病毒疫苗肽的潛力，可用于綿羊肺瘤的預(yù)防。將本試驗所用CT-KLH多肽作為疫苗肽，預(yù)防綿羊肺腺瘤，除了需要檢測綿羊是否會產(chǎn)生特異性抗體外，還需要驗證該多肽的安全性。研究證明綿羊肺腺瘤病毒的囊膜基因是致瘤基因[18-19]，編碼的囊膜蛋白可誘導(dǎo)鳥成纖維細胞[20]、鼠成纖維細胞[21-23]、狗腎上皮細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[24-25]，將綿羊肺腺瘤病毒的囊膜基因與腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)連接構(gòu)建表達載體，以勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)的啟動子啟動表達JSRV的囊膜蛋白，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)5個月后可誘發(fā)肺瘤并致死[26]。當將啟動子改為JSRV自身的強啟動子LTR后，在具有免疫力的小鼠體內(nèi)2.5個月后可發(fā)生癌變[27]。M.Palmarini等[28]通過替換JSRV跨膜蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)的酰肌醇3磷酸激酶結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)JSRV囊膜蛋白對鼠成纖維細胞的轉(zhuǎn)化率降低，證明JSRV的胞質(zhì)尾區(qū)蛋白對細胞的轉(zhuǎn)化作用必不可少。但是JSRV跨膜蛋白亞基胞質(zhì)尾區(qū)蛋白在細胞內(nèi)和動物體內(nèi)單獨表達是否會引起細胞轉(zhuǎn)化和致瘤并未確定，所以本試驗所用CT-KLH多肽為制備綿羊肺腺瘤的候選疫苗肽提供新思路，但臨床應(yīng)用需要進一步驗證。

由于JSRV缺乏體外培養(yǎng)體系，不能檢測本試驗制備的單克隆抗體對綿羊肺腺瘤病毒的中和活性，但Western blot和免疫組織化學(xué)試驗證明，CT單克隆抗體與變性和天然的OPA病原發(fā)生免疫反應(yīng)，說明CT單抗識別的是一個線性表位。

目前，國內(nèi)尚無綿羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白單克隆抗體制備的報道；本研究通過分析目的蛋白的跨膜區(qū)，合成多肽制備跨膜蛋白抗胞質(zhì)尾區(qū)的CT單克隆抗體，并初步建立了雙抗體夾心ELISA方法。本試驗建立的雙抗體夾心ELISA，檢測綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性好，最低檢出質(zhì)量濃度為0.034 mg·mL-1，通過用本試驗建立的方法檢測羊常見疫病的疫苗，證明羊的常見疫病不會影響本試驗建立的檢測方法。使用HRP標記的CT單抗，用提前包被多抗并封閉好的的酶標板檢測只需150 min即可得出結(jié)果，有利于高通量快速檢測綿羊肺腺瘤。

4 結(jié) 論

通過生物信息學(xué)分析綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白，預(yù)測到一段抗原性好并位于內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒與外源性綿羊肺腺瘤病毒主要高可變區(qū)的抗原表位，合成該表位多肽后免疫小鼠，成功地篩選出1株穩(wěn)定分泌抗JSRV-CT的單克隆抗體的細胞株，該抗體可識別變性和天然的綿羊肺腺瘤病毒粒子，用單抗建立的綿羊肺腺瘤雙抗體夾心ELISA檢測方法特異、穩(wěn)定且靈敏快速，有利于高通量的檢測。

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(編輯 白永平)

Preparation of the Monoclonal Antibody against Envelope Protein of JSRV and Development of Double Antibody Sandwich ELISA for JSRV

LIU Yue1，ZHANG Yu-fei1，SUN Xiao-lin1，LIU Shu-ying1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Huhhot010018，China； 2.KeyLaboratoriesofAgricultureforAnimalClinicalDiagnosisTechnology，Huhhot010018，China)

In order to prepare monoclonal antibody against the cytoplasmic tail of the envelope protein of Jaagsiekte sheep retrovirus(JSRV)，the amino acid sequence of the JSRV envelope protein was analyzed by bioinformatics to synthetize polypeptide.Then the polypeptide was connected with Keyhole Limpet hemocyanin(CT-KLH) or bovine serum albumin(CT-BSA)，respectively.Polypeptide CT-KLH was immunized to the BALB/c mice as antigen，and the spleen cells of immunized mice were fused with SP2/0 myeloma cells.An indirect ELISA was developed to screen positive antibody producing cells using the CT protein.A hybridoma stably secreting MAb designated as 8E5 was obtained against CT protein.The monoclonal antibody belonged to IgG2a/κ.The titers of supernatant and ascites were 6.4×103and 1×105as detected by ELISA，respectively.The results of western blot and immunohistochemistry showed that this hybridoma secreted MAb could react specifically with the JSRV.The results suggested that the MAb-8E5 is important diagnostic reagents for detection of ovine pulmonary adenocarcinoma (OPA).A sandwich ELISA was established by using 8E5 secreted monoclonal antibody.The results indicated that the ELISA possessed good specificity and repeatability，and higher sensitivity.The monoclonal antibody could be used in diagnosis for OPA and further research of envelope protein function.

Jaagsiekte sheep retrovirus；envelope protein；B cell epitopes；monoclonal antibody；ELISA

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.016

2014-05-28

國家自然科學(xué)基金(31160493；31360597)；內(nèi)蒙古科技創(chuàng)新引導(dǎo)基金項目(20130224)；教育部博士點基金博導(dǎo)類項目(20111515110008)

劉 月(1986-)，女，遼寧康平人，博士生，主要從事動物生理學(xué)和病理學(xué)研究，E-mail：liuyue105219@163.com

*通信作者：劉淑英，博士生導(dǎo)師，E-mail：liushuying-imau@126.com

S852.659.3

A

0366-6964(2015)05-0800-08