抗性選育協同疫苗免疫對雞羽囊馬立克病毒載量的影響

金元昌，陳 壯，李玉峰，袁志棟

(1.湖南科技大學 生命科學學院，湘潭 411201； 2.廣西大學 養禽與禽病研究所，南寧 530004)

抗性選育協同疫苗免疫對雞羽囊馬立克病毒載量的影響

金元昌1，2*，陳 壯1，李玉峰1，袁志棟1

(1.湖南科技大學 生命科學學院，湘潭 411201； 2.廣西大學 養禽與禽病研究所，南寧 530004)

為了研究馬立克病(MD)火雞皰疹病毒(HVT)疫苗接種和抗性選育對雞馬立克病毒(MDV-1)攻毒后羽囊中病毒載量的影響，選擇普通霞煙雞及其MD抗性品系，利用MDV-1攻毒后第7、14、21、28和35 天(DPI)五次采集并分離的全部試驗雞的羽囊為材料，采用Real-time FQ-PCR技術對這些材料中meq基因進行絕對定量分析以確定其病毒載量，用來分析比較MDV-1在MD抗性/普通雞及HVT疫苗免疫/HVT疫苗未免疫雞體內的增殖情況。結果顯示：1)從MD抗性對病毒載量的影響看，一方面，普通非免疫攻毒組(F組)的MDV-1含量于14、21DPI時顯著(P<0.05)高于MD抗性非免疫攻毒組(T組)；另一方面，MD抗性免疫攻毒組(R組)的MDV-1含量總體上卻和普通免疫攻毒組(G組)相當。2)從HVT疫苗免疫對病毒載量的影響看，一方面，MD抗性非免疫攻毒組(T組)的MDV-1含量于28 DPI時顯著(P<0.05)高于MD抗性免疫攻毒組(R組)；另一方面，普通非免疫攻毒組(F組) 的MDV-1含量于14、21 DPI時顯著(P<0.05)高于普通免疫攻毒組(G組)。3)從MD抗性協同HVT疫苗免疫對病毒載量的影響看，普通非免疫攻毒組(F組)的MDV-1含量于14(P<0.05)、28(P<0.01)、35(P<0.05)DPI時顯著高于MD抗性免疫攻毒組(R組)。結果表明，雞MD抗性選育協同HVT疫苗接種可顯著降低雞羽囊的病毒載量，這將會降低MDV-1傳播風險，并提高雞的存活機會。

馬立克病毒；羽囊；實時定量PCR；抗性選育；絕對定量

馬立克病(Mark’s disease，MD)是由馬立克病病毒(Mark’s disease virus，MDV)引起的一種惡性T淋巴細胞腫瘤，病毒經空氣傳播，傳染力強，被感染雞表現為神經系統紊亂、腫瘤和死亡，是危害世界養禽業的三種主要疾病之一。

在被MDV感染的雞的所有組織中，只有雞羽毛囊上皮細胞可產生大量有囊膜的、完全具有感染性的病毒粒子，因而羽囊在MDV傳播中起重要作用。雞羽毛囊上皮細胞中的病毒粒子有囊膜，隨角化細胞脫落，成為傳染性很強的無細胞病毒。能夠對羽囊中MDV進行檢測是非常有用的，因為羽囊能夠在不要求殺死雞的情況下，在一定的時間段內簡便地作為樣本以便對MDV的定性[1-2]及定量檢測。對潛入雞個體羽囊中MDV含量的測定能有助于判定疫苗對雞是否有效，也能用于協助確定疫苗使用的最佳路線、接種疫苗的最佳時間等。對于被MDV感染的雞，羽囊中的病毒負載量可能也是發病情況以及傳染能力的一個有用的預測器。

在對MDV基因組DNA 70～80個特異區域或基因進行的生物學功能研究中，共計46個MDV特異性多肽得到鑒定，將它們分成三類：糖蛋白基因(gB等)，致瘤相關基因(132-bpr序列、meq和pp38)及其他基因。1992年，meq基因首次由D.Jones等[3]鑒定，更重要的是發現它在MDV導致的T淋巴細胞瘤中高度表達。J.L.Liu等[4]通過meq基因的結構以及制備單克隆抗體對meq基因進行了較全面的研究，根據試驗結果推斷，meq是一個多功能的轉錄因子，可能對MDV和宿主細胞的基因表達有調控作用。

作者利用Real-time FQ-PCR絕對定量法，通過對MDV-1攻毒后MD抗性與普通霞煙雞meq基因拷貝數的絕對定量，從而對羽囊中MDV-1含量進行檢測，以分析比較MDV-1在MD抗性雞組/普通雞組，及HVT疫苗免疫雞組/HVT疫苗未免疫雞組體內的增殖情況。

1 材料與方法

1.1 病毒和實驗動物

MDV-1強毒株YL040920/C6株為廣西大學養禽與禽病研究所分離[5-6]并保存。7日齡健康霞煙雞來自廣西容縣科技局實驗雞場保種的霞煙雞MD抗性品系核心群[7-10]的后代。

1.2 主要試劑和儀器

SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real-Time)購自TaKaRa公司；Light Cycle2.0 型PCR 儀為德國 ROCHE 公司產品。

1.3 雞攻毒試驗

利用YL040920/C6攻毒的DEF細胞培養物，按每羽0.3 mL對實驗雞進行腹腔注射，1個月后翼下采集抗凝血，并分離雞的外周血淋巴細胞，經禽腫瘤病三重PCR診斷技術[11]檢測呈單一MDV-1攻毒后，采集雞翅靜脈抗凝血(經病毒蝕斑計數每0.4 mL血液含2 500 PFU的MDV-1)作為攻毒材料。試驗分組：74羽普通霞煙雞分為E組(未攻毒、未免疫的空白對照組，20羽)、F組(未免疫、MDV-1攻毒組，24羽)和G組(HVT免疫、MDV-1攻毒組，30羽)三組；77羽MD抗性霞煙雞分為S組(未攻毒、未免疫的空白對照組，20羽)、T組(未免疫、MDV-1攻毒組，30羽)和R組(HVT免疫、MDV-1攻毒組，27羽)三組。7 d齡時取準備好的攻毒材料腹腔(0.4 mL·羽-1)注射F、G、T、R組雞，于第7、14、21、28、35天(DPI)采集所有試驗雞有髓質的羽囊，按常規方法將試驗雞隔離飼養，期間要記錄攻毒后死亡雞及存活雞的腫瘤發生及其檢測結果。

1.4 羽囊總DNA的提取

采集有髓質的試驗雞的羽囊，擠壓出羽髓并剪下羽毛根，研磨后按1∶5(W/V)加入PBS，反復凍融3 次，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；取300 μL 上清，加入等體積的組織裂解液及5 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)，50 ℃消化2 h，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；吸取上清，加入等體積的Tris 飽和酚，充分振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心 10 min；取上層的水相加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；取上層的水相加入2 倍體積預冷的無水乙醇和1/10 體積的3 mol·L-1乙酸鈉，在-20 ℃放置2 h；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min；小心傾棄上清，沉淀用70%乙醇1 mL 于4 ℃ 8 500 r·min-1離心 5 min 漂洗后，傾棄上清，室溫風干15 min，用40 μL 含RNase A(終濃度為20 μg·mL-1)的TE 緩沖液溶解，放置-20 ℃備用。

1.5 羽囊中meq基因Real-time FQ-PCR

以上述提取的試驗雞羽囊(分別于7、14、21、28 和 35 DPI)的DNA為模板，每個樣本的模板重復2孔，利用已建立的檢測meq基因的Real-time FQ-PCR方法[12]擴增并檢測熒光，得到模板起始拷貝數所對應的Ct值。

1.6 數據表示和統計分析

Real-time FQ-PCR反應后，將得到的各樣品模板的起始拷貝數所對應的Ct值代到meq基因標準曲線公式[12](Ct值即y值)：y=-3.32x+34.94中，計算每個樣品中所含meq基因的拷貝數，再計算出MDV-1基因組的拷貝數(每個MDV基因組含兩個meq基因)。采用t檢驗對每組MDV-1基因組含量進行差異顯著性分析。

2 結 果

未攻毒的兩個對照組(S、E組)羽囊中均無MDV-1檢出。試驗雞的各攻毒組羽囊中 MDV-1在攻毒后第7天就開始被檢測到，但是第7天只能檢測到極少的量，在第14天達到最高峰，然后在第21、28、35天逐漸減少(表1)。

2.1 MD抗性品系羽囊中病毒載量的動態變化比較

在MDV-1攻毒后不同時間，測定MD抗性雞的免疫攻毒組(R組)和非免疫攻毒組(T組)羽囊中MDV-1含量，結果見表1，T組的MDV-1含量于14、35 DPI時高于(P>0.05)R組，于28 DPI時顯著高于(P<0.05)R組，于21 DPI時稍低于(P>0.05)R組。結果表明，對于MD抗性雞，T組的MDV-1含量部分高于R組。

組別Group接種后不同時間(DPI)的病毒載量(log10/106個細胞)LoadofMDV-1indifferentdaypostinfection(log10/106cells)714212835T0±02.789±0.078b2.725±0.062bc2.396±0.049a2.071±0.062abR0±02.756±0.128b2.797±0.145ab2.305±0.045bc1.981±0.032bcF0±02.963±0.040a2.917±0.037a2.406±0.045aA2.149±0.110aG0±02.813±0.035b2.774±0.039b2.354±0.025ab2.104±0.076ab

同列中含相同字母肩注表示差異不顯著(P>0.05)；肩注小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；肩注大小寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)

In the same column，the same letter means no significant difference between treatments (P>0.05)；different small letters mean significant difference (P<0.05)；the different capital and small letters mean extremely significant difference (P<0.01)

2.2 普通品系雞(F/G)組內羽囊中病毒載量的動態變化比較

在MDV-1攻毒后不同時間，測定普通雞的免疫攻毒組(G組) 和非免疫攻毒組(F組)羽囊中MDV-1含量，結果見表1，F組的MDV-1含量于14、21 DPI時顯著高于(P<0.05)G組，于28、35 DPI時高于(P>0.05)G組。結果表明，對于普通雞，F組的MDV-1含量部分高于G組。

2.3 普通雞(F/G)和MD抗性雞(T/R)組間羽囊中病毒載量的動態變化比較

在MDV-1攻毒后不同時間，MD抗性非免疫攻毒組(T組)和普通非免疫攻毒組(F組)羽囊中MDV-1含量結果見表1，F組的MDV-1含量于14、21DPI時顯著高于(P<0.05)T組，于28、35 DPI時高于(P>0.05)T組。結果表明，F組的MDV-1含量部分高于T組。

在MDV-1攻毒后不同時間，MD抗性免疫攻毒組(R組)和普通免疫攻毒組(G組)羽囊中MDV-1含量見表1，G組的MDV-1含量于14、28、35 DPI時高于(P>0.05) R組，于21 DPI時稍低于(P>0.05) R組。結果表明，G組的MDV-1含量總體上和R組相當。

在MDV-1攻毒后不同時間，測定MD抗性非免疫攻毒組(T組)和普通免疫攻毒組(G組)羽囊中MDV-1含量，結果見表1，G組的MDV-1含量于14、21、35 DPI時高于(P>0.05) T組，于28 DPI時稍低于(P>0.05) T組。結果表明，G組的MDV-1含量總體上和T組相當。

在MDV-1攻毒后不同時間，測定MD抗性免疫攻毒組(R組)和普通非免疫攻毒組(F組)羽囊中MDV-1含量，結果見表1，F組的MDV-1含量于14(P<0.05)、35(P<0.05) DPI時顯著高于R組，于28 DPI時極顯著高于(P<0.01)R組，于21 DPI時高于(P>0.05) R組。結果表明，F組的MDV-1含量總體上高于R組。

3 討 論

MDV按其致病性和血清學反應不同分為三個血清型：血清Ⅰ型(MDV-1)，包括所有致瘤致病的強毒株及其弱化株以及天然弱毒株；血清Ⅱ型(MDV-2)，為自然的非致瘤株；血清Ⅲ型(MDV-3)，為火雞皰疹病毒(hepresviurs of turkeys，HVT)，對雞沒有致病性。三個血清型之間具有一定的交叉免疫保護。因此，自從20世紀70年代以來，MD的預防很大程度上依靠使用血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒的單價、二價或多價疫苗接種。

疫苗免疫、抗病育種和生物安全是控制MD的三大主要措施。由于多方面的原因：強毒株和野外變異株的不斷出現、雛雞的早期感染、MDV的廣泛存在以及疫苗使用不當，導致免疫雞群甚至于免疫過CVI988/Rispens株疫苗(目前最好的MD疫苗)的雞群仍有MD的暴發。目前，雞的基因組序列已完成，加之更為高效疫苗的研究變得越來越難的情形下，促使人們更重視抗病育種，采用遺傳學方法從遺傳本質上提高家禽的抗病能力就成為有效控制MD的重要策略。研究者們注意到不同遺傳品系的雞對MD的易感性不同，并研究培育出抗MD的雞品系。本研究中所用實驗雞就是李康然等在20世紀90年代初期用表型遺傳標記選育的方法選育的廣西抗MD霞煙雞[7]。

本研究就MD抗性選育和疫苗免疫對雞羽囊MDV-1載量的影響進行了初步的分析比較，從MD抗性對病毒載量的影響看，普通非免疫雞MDV-1的含量在兩個時間點上顯著高于MD抗性非免疫雞間，然而，MD抗性免疫攻毒組MDV-1含量和普通免疫攻毒組總體上相當，這說明非免疫情況下MD抗性雞相對于普通雞保持了較好的MD抗性水平，不過，免疫因素使情況變得復雜了。從HVT疫苗免疫對病毒載量的影響看，MD抗性非免疫攻毒組MDV-1的含量在一個時間點上顯著高于MD抗性免疫攻毒組，普通非免疫攻毒組MDV-1含量在兩個時間點上顯著高于普通免疫攻毒組，這說明HVT疫苗對MD感染雞群具有極大的保護作用。尤其引人注意的結果是，普通非免疫攻毒組MDV-1含量在三個時間點上顯著高于MD抗性免疫攻毒組，說明MD抗性選育協同HTV疫苗對雞MD具有更強的抵抗作用。與之相反，MD抗性非免疫攻毒組MDV-1含量和普通免疫攻毒組近似，說明MD抗性育種對病毒載量的影響也許和HVT疫苗免疫對病毒載量的影響相互抵消了。總之，雞MD抗性選育協同HTV疫苗接種可顯著降低雞羽囊的病毒載量。理論上，該結果為較深入地探究雞抗MD的遺傳基礎及其分子機制提供了實驗依據；同時也為MD的預防等實踐工作提供了思路。

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(編輯 白永平)

Effects of Resistance Selection in Coordination with Vaccination on MDV-1 Loads in Feather Follicle of Chickens

JIN Yuan-chang1，2*，CHEN Zhuang1，LI Yu-feng1，YUAN Zhi-dong1

(1.CollegeofLifeScience，HunanUniversityofScienceandTechnology，Xiangtan411201，China；
2.PoultryScienceandHealth，GuangxiUniversity，Nanning530004，China)

The aim of the present study was to study the effects of HVT-vaccinated and MD resistant selection on virus loads in feather follicle of chickens after the challenge with MDV-1.Real-time FQ-PCR was used for absolute quantification of the DNA levels ofmeqof feather follicle sampled in 5 different times(7，14，21，28，35 DPI) from all chickens after the challenge for quantification of MDV-1.The load of MDV-1 was detected in feather follicle to analyzed and compared proliferation of MDV-1 in resistant/common or/and HVT-vaccinated/HVT-unvaccinated chickens.The results showed that 1) from the impact of MD-resistant on the MDV-1 loads，the load of MDV-1 were significantly higher in chickens of F group(common line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) whereas significantly lower(P<0.05) in chickens of T group(MD-resistant line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) in 14，21 DPI；On the one hand，R group(MD-resistant line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) and G group(common line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) give about the same load of MDV-1；2) From the impact of HVT-vaccinated on the MDV-1 loads，the load of MDV-1 were significantly higher in chickens of T group(MD-resistant line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) whereas significantly lower(P<0.05) in chickens of R group(MD-resistant line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) in 28 DPI；On the one hand，the load of MDV-1 were significantly higher in chickens of F group(common line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) whereas significantly lower(P<0.05)in chickens of G group(common line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) in 14，21 DPI：3) From the impact of MD-resistant and HVT-vaccinated on the MDV-1 loads，the load of MDV-1 were significantly higher in chickens of F group(common line，HVT-unvaccinated and MDV-challenged) whereas significantly lower in chickens of R group(MD-resistant line，HVT-vaccinated and MDV-challenged) in 14(P<0.05)，28(P<0.01) and 35(P<0.05)DPI.These results indicated that the virus loads in feather follicle of chickens can be reduced significantly by resistance selection in coordination with vaccination，which will reduce the risk of MDV-1 transmission and improve the chicken’s chance of survival.

Marek’s disease virus(MDV)；feather follicl；Real-time FQ-PCR；resistance selection；absolute quantization

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.021

2014-09-17

湖南省自然科學基金項目(13JJ6055)；湖南省普通高校化學與生物科學類專業大學生創新訓練中心(G21323)；湖南科技大學化學與生物學省級大學生創新訓練中心項目

金元昌(1969-)，男，山東日照人，副教授，博士，主要從事分子病毒學與基因工程方面的研究

*通信作者：金元昌，E-mail：404340774@qq.com

S852.659.1

A

0366-6964(2015)05-0836-05