基于GWAS后分析策略研究TRAPPC9基因對奶牛產奶性狀的遺傳效應

董易春，劉 超，王 曉，王雅春，張 毅，孫東曉，張勝利，張 勤，張 沅，俞 英

(中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

基于GWAS后分析策略研究TRAPPC9基因對奶牛產奶性狀的遺傳效應

董易春，劉 超，王 曉，王雅春，張 毅，孫東曉，張勝利，張 勤，張 沅，俞 英*

(中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

本研究基于課題組前期對北京地區中國荷斯坦牛群體產奶性狀全基因組關聯分析結果，在新的中國荷斯坦牛群中將轉運蛋白顆粒復合體9(TRAPPC9)基因作為產奶性狀的候選基因進行遺傳效應驗證。研究利用混池測序尋找SNPs位點，結合前期GWAS結果篩選到的SNPs位點，進而分析這些多態性位點與中國荷斯坦牛產奶性狀的相關性。結果發現，SNP1、SNP2位點對乳蛋白率和乳糖率效應均顯著(P<0.05)；SNP3位點對乳脂率和乳蛋白率的效應均極顯著(P<0.01)；SNP4位點對乳脂率有極顯著影響(P<0.01)；SNP5位點對乳脂率和乳糖率的效應顯著(P<0.05)。同時發現TRAPPC9基因的表達量對產奶性狀也有顯著影響(P<0.05)，而TRAPPC9基因啟動子區DNA甲基化對產奶性狀無直接顯著影響。該結果進一步表明，TRAPPC9基因可以考慮作為分子遺傳標記應用于中國荷斯坦牛產奶性狀的標記輔助選擇。

產奶性狀；TRAPPC9基因；SNP；DNA甲基化

轉運蛋白顆粒復合體9(Trafficking protein particle complex 9，TRAPPC9)基因位于奶牛14號染色體，編碼的轉運蛋白顆粒復合體9蛋白也叫NIK及IKKβ結合蛋白(NIK and IKKβ-binding protein)，簡稱NIBP。NIBP具有參與NF-κB信號通路激活的過程、參與膜泡運輸、參與內質網到高爾基體的囊泡轉移和參與神經細胞的分化等功能[1-2]。NF-κB信號通路在乳房炎的發生發展中發揮著重要的調控作用[3]，而NIBP能夠與激酶NIK和IKKβ相互作用，促進NF-κB信號通路的激活[4-5]。

本課題組前期利用Illumina公司Bovine 50K芯片對北京地區中國荷斯坦奶牛群體2 093頭泌乳牛的產奶性狀和乳房炎抗性分別進行全基因組關聯分析(Genome wide association study，GWAS)，發現在奶牛TRAPPC9基因上存在6個顯著SNPs位點，其中ARS-BFGL-NGS-100480與產奶量、乳蛋白量、乳脂率[6-7]以及乳房炎抗性[8]關聯顯著，ARS-BFGL-NGS-56327、UA-IFASA-5306、UA-IFASA-5765、ARS-BFGL-BAC-25166和 Hapmap27703-BTC-053907與乳脂率關聯顯著[6-7]。因此，將TRAPPC9基因作為奶牛產奶性狀和乳房炎抗性潛在候選基因。

自2005年R.J.Klein等[9]首次通過GWAS方法對年齡相關的視網膜黃斑變性綜合征進行研究以來，至今已有1 000多篇關于人類復雜疾病的一系列GWAS報道[10]。在奶牛上，目前也有很多國家報道了奶牛多個重要經濟性狀的GWAS結果[11-12]。然而，GWAS僅僅找到了對表型影響顯著的變異，卻沒法解釋這些變異是如何影響表型的變化。2010年，美國多個研究機構基于人類癌癥GWAS結果實施“post-GWAS”項目，標志著GWAS后分析策略時代的到來。GWAS后分析策略是指從基因組序列、表觀遺傳學、基因表達、蛋白質表達豐度、信號通路、細胞組織模型等方面來解釋這些顯著變異影響表型的生物學機制[10,13]。目前，在人類復雜疾病上已經開展很多GWAS后分析策略的研究[14-15]，而在奶牛上的相關報道甚少。本研究基于課題組前期GWAS結果，在新的中國荷斯坦牛群體中將TRAPPC9基因作為產奶性狀的候選基因進行遺傳效應驗證，并從mRNA和DNA甲基化水平對其影響產奶性狀的分子機制進行探索，確定其能否作為可靠的分子遺傳標記應用于奶牛產奶性狀的標記輔助選擇。

1 材料方法

1.1 材料

本研究以中國北方地區6個牛場514頭具有完整DHI、年齡及胎次等生產數據，飼養管理水平一致的中國荷斯坦牛作為試驗動物，同時采集奶樣和血樣。采集的奶樣送至北京奶牛中心進行DHI測定，獲得乳脂率、乳蛋白率、乳糖率以及體細胞數等表型數據。本研究中所有引物均與課題組前期研究[16]一致，故不再展示。

1.2 方法

1.2.1 血液DNA提取 血液樣品的DNA提取利用天根血液組織提取試劑盒提取，TB緩沖液溶解后，利用NANODROP2000紫外分光光度計和凝膠電泳檢測DNA提取質量，將檢測合格的DNA置于-20 ℃保存備用。

1.2.2TRAPPC9多態性位點測序篩選 參照牛TRAPPC9基因序列(Gene ID：533451)，結合課題組前期的研究進展在TRAPPC9基因啟動區和GWAS分析顯著SNP位點附近分別設計引物，隨機挑選20頭奶牛的基因組DNA，等量混合為池DNA作為模板進行PCR擴增。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統進行成像，將合格的PCR產物送往華大公司進行測序，確定SNP位點。

1.2.3 SNP分型 將上一步確定的SNP利用ABI公司的Multiplex SnaPshot 微測序技術進行SNP分型。主要步驟：①引物設計：由于待分型的多個核酸片段需要在同一個反應體系中進行多重PCR反應，因此需對目的SNPs進行多重PCR設計，每個SNP設計1對擴增引物和1個延伸引物；②多重PCR擴增；③PCR產物純化：取3 μL PCR產物用ExoI和FastAP純化，其中ExoI用來去除反應產物中的剩余引物，FastAP用來去除反應中剩余的dNTP；④延伸反應：純化后預先混好延伸引物，進行延伸反應；⑤測序取1 μL延伸產物，加10 μL上樣緩沖液，95 ℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀進行檢測。

1.2.4 RNA提取與反轉錄 血液總RNA利用百泰克血液總RNA提取試劑盒進行提取，RNase free ddH2O溶解后，利用NANODROP2000紫外分光光度計和凝膠電泳檢測RNA提取質量，檢測合格的RNA通過TaKaRa反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA，-80 ℃保存備用。

1.2.5 基因表達量檢測 本研究利用實時熒光定量(qPCR)方法來檢測TRAPPC9基因的表達量，GAPDH作為內參基因，采用的試劑盒和儀器分別為Roche公司的LightCycler?480 SYBR GreenⅡMaster和LightCycler?480。利用2-ΔΔCt相對定量分析法對TRAPPC9基因的表達量進行分析。1.2.6 基因組DNA處理和PCR擴增 將基因組DNA用亞硫酸氫鹽進行處理，使基因組中未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，然后使用ZYMO Premix進行PCR反應，PCR反應總體系為40 μL，其中Premix 20 μL，ddH2O 14 μL，上游引物(10 μmol·L-1)1 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.1 μL，通用引物0.9 μL，處理后的DNA模板4 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸35 s，共45個循環；72 ℃延伸10 min；其中退火溫度為每對引物經梯度PCR所確定的最適退火溫度。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格的PCR產物進行下一步的測序。

1.2.7 基因組DNA甲基化水平檢測 本研究利用QIAGEN公司的焦磷酸測序儀對上一步獲得的PCR產物進行DNA甲基化水平定量檢測，同時利用該公司提供的Pyro Q-CpG軟件進行測序Assay設計及相關參數設定。試驗步驟參照本課題組前期研究報道[17-18]，測序完成后，利用Pyro Q-CpG軟件分析出測序結果，從而獲得待測樣品DNA甲基化水平數據，并利用克隆測序對結果進行驗證。

1.2.8 數據分析TRAPPC9基因SNP對產奶性狀的遺傳效應利用SAS9.1的MIXED過程進行關聯分析，模型：y=μ+hys+p+m+h+g+a+e，其中，y為表型值，μ為群體均值，hys為場年季效應，p為胎次效應，m為泌乳階段效應，h為健康狀態效應，g為基因型效應，a為個體隨機加性遺傳效應，e為隨機殘差效應。其中健康狀態劃分標準：等級1：SCC≤20×104·mL-1；等級2：20×104·mL-1

2 結 果

2.1 SNP分型結果

在中國荷斯坦牛TRAPPC9基因啟動子區和GWAS關聯顯著位點處設計引物，對池DNA進行PCR擴增，對擴增進行測序(圖1-圖3)。測序結果共發現5個SNPs(表1和圖4所示)，其中4個為T/C突變(圖1A)，1個為T/G突變(圖1B)。如圖4所示，SNP1位于基因的啟動子區，TFSEARCH軟件預測其為3個轉錄因子的結合位點，SNP2位于外顯子上，SNP3位于內含子上，SNP4和SNP5則分別為課題組前期GWAS報道顯著的位點ARS-BFGL-NGS-100480和Hapmap27703-BTC-053907。利用Multiplex SnaPshot 微測序技術對發現的5個SNPs進行分型，圖2為TRAPPC9基因上SNP3(T2525852G)的SnaPshot分型結果示例，由于微測序采用的是反向引物，故圖2A、2B、2C分別代表GG、GT和TT基因型。

利用Excel統計TRAPPC9基因上述5個SNPs位點的等位基因頻率和基因型頻率，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，分析結果如表2所示。結果表明這5個位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態。

表1TRAPPC9基因5個SNPs信息表

Table 1 Information of SNPs inTRAPPC9 gene

SNP位置Location物理位置(Btau_4.6.1)Physicallocation突變MutationSNP1啟動子區2477531C-TSNP2第2外顯子2484891C-TSNP3第6內含子2525852T-GSNP4第16內含子2607583T-CSNP5第20內含子2833449T-C

圖1 TRAPPC9基因SNP1(A)和SNP3(B)正向測序圖Fig.1 SNP1(A) and SNP3(B) of TRAPPC9 gene identified by frontal sequencing

圖2 T2525852G位點SnaPshot微測序峰圖Fig.2 SnaPshot sequencing of T2525852G site

表2 中國荷斯坦牛TRAPPC9等位基因頻率和基因型頻率

Table 2 Genotypic frequency and allele frequency ofTRAPPC9 gene in Chinese Holsteins

SNP基因型頻率Genotypicfrequency等位基因頻率AllelefrequencyAAABBBABχ2P值P-valueSNP1C2477531T0.370.500.130.620.380.970.33SNP2C2484891T0.960.040.000.980.020.160.69SNP3T2525852G0.150.510.340.410.592.060.15SNP4T2607583C0.340.520.140.600.401.710.19SNP5T2833449C0.160.440.400.620.381.150.28

2.2TRAPPC9基因SNP與產奶性狀的關聯

表3所示為TRAPPC9基因SNPs不同基因型對中國荷斯坦牛產奶性狀的影響。可見SNP1位點對乳蛋白率和乳糖率的效應顯著(P<0.01)，CT型的乳蛋白率極顯著低于TT型，而CT基因型的乳糖率則極顯著高于CC和TT型(P<0.01)；SNP2位點對乳蛋白率和乳糖率的影響顯著(P<0.05)，其中CC基因型的乳蛋白率顯著低于CT型；SNP3位點對乳脂率和乳蛋白率的效應均極顯著(P<0.01)，其中TT和GG基因型的乳脂率極顯著高于TG型，TT基因型的乳糖率極顯著高于TG型；SNP4位點對乳脂率的效應極顯著(P<0.01)，其中CC型極顯著高于TC和TT型，TT基因型極顯著高于TC型；SNP5位點對乳脂率和乳糖率的效應顯著(P<0.05)，其中CC基因型的乳脂率顯著高于CT型，CC基因型的乳糖率極顯著高于CT型。

2.3TRAPPC9基因表達量與產奶性狀的關系

表3TRAPPC9基因SNPs與產奶性狀關聯分析(最小二乘均值±標準誤)

Table 3 Associations of SNPs ofTRAPPC9 gene with milk production traits in Chinese Holsteins(LSM±SE)

SNP基因型Genotype乳脂率/%Fatpercentage乳蛋白率/%Proteinpercentage乳糖率/%LactosepercentageSNP1CC3.29±0.073.29±0.034.50±0.04ACT3.35±0.063.23±0.02A4.61±0.03BTT3.26±0.103.34±0.04B4.45±0.05AP值0.54270.00700.0011SNP2CC3.32±0.063.27±0.02a4.54±0.03aCT2.35±0.134.16±0.08b3.75±0.09bP值0.15340.01690.0357SNP3TT3.64±0.08A3.35±0.03A4.53±0.04TG3.10±0.06B3.23±0.02B4.56±0.03GG3.57±0.07A3.27±0.034.57±0.04P值<0.00010.00020.6040SNP4CC3.78±0.10A3.35±0.044.58±0.05CT3.18±0.06B3.27±0.024.57±0.03TT3.46±0.07C3.29±0.024.56±0.04P值<0.00010.08380.8108SNP5CC3.38±0.05a3.32±0.03A4.59±0.04CT3.27±0.04b3.24±0.02B4.55±0.03TT3.31±0.063.25±0.034.52±0.05P值0.04620.00970.2835

a，b.同一組數據有不同上標表示差異顯著(P<0.05)；A，B.同一組數據有不同上標表示差異極顯著(P<0.01)

a，b.In the same row means significant difference between genotypes(P<0.05)；A，B.In the same row means significant difference between genotypes(P<0.01)

關聯分析結果表明，本研究中TRAPPC9基因的5個SNPs及其mRNA表達量對產奶性狀均有顯著影響。為了分析本研究中5個SNPs是否影響基因的表達，將上述40頭牛按照每種SNP的基因型分組進行方差分析，最后發現SNP3不同基因型表達量差異顯著(P<0.05)，多重檢驗表明TT基因型的表達量顯著高于GT型(P<0.05，圖3D)，這與關聯分析的結果相似。

2.4 TRAPPC9基因啟動子區甲基化與產奶性狀的關系

在TRAPPC9基因啟動子區選擇2個區域進行甲基化水平分析，如圖4所示的R1和R2區域，其中R1區域第3個CpG座位同時也為SNP1所在的位置，故該座位為CpG-SNP座位。

對同一地區2個牛場的155頭中國荷斯坦牛上述區域R1和R2進行甲基化水平的分析，區域R1的甲基化水平如圖5所示，第1個CpG座位為100%甲基化；第2個CpG座位甲基化水平為100%；第3個座位為CpG-SNP，該座位為C→T的突變，其甲基化程度與SNP基因型有很大關系，當其基因型為CC型時，其甲基化水平為100%，當基因型為CT型時，其甲基化水平為60%，當其基因型為TT型時，則不存在甲基化位點，其甲基化水平為0%，說明該區域的甲基化對產奶性狀的效應等同于SNP1的效應。

區域R2，由于該區域處于CpG島，CpG座位甲基化水平普遍較低。第1個CpG座位平均甲基化水平為6.81%；第2個CpG座位分兩類，一類為未甲基化，另一類為甲基化，其平均甲基化水平為5.97%；第3個CpG座位的平均甲基化水平為5.80%；第4個CpG座位的平均甲基化水平為6.29%。其中第1、3、4座位的甲基化水平在各個個體中幾乎沒有區別；第2個座位的甲基化水平為質的變異，但其是否發生甲基化對產奶性狀并無顯著影響(表4)。

圖3 TRAPPC9基因表達水與產奶性狀的關系Fig.3 Relationship between expression of TRAPPC9 and milk production traits

圖4 TRAPPC9 SNP座位和甲基化區域示意圖Fig.4 SNP site and methylation region of TRAPPC9

圖5 TRAPPC9基因啟動子區域1甲基化水平示意圖Fig.5 The methylation level of region 1 of TRCPPC9

3 討 論

目前，NCBI上已經報道牛TRAPPC9基因上有3 000多個SNPs，其中28個SNPs在外顯子上[19-20]。本課題組前期進行GWAS所使用的芯片僅覆蓋了其中的16個SNPs，且均在內含子上。本研究在課題組前期結果的基礎上，增加了3個SNPs，分別位于基因的啟動子區、外顯子區和內含子區，關聯分析結果表明這些SNP均與產奶性狀具有顯著關聯，其中SNP4和SNP5與乳脂率關聯顯著，這與課題組前期GWAS報道的結果[6-7]一致。本研究中，SNP3位點與乳脂率和乳蛋白率關聯均極顯著，前期研究[21]報道該位點與乳脂率和細胞因子IFN-γ關聯顯著。SNP2位點為位于第2外顯子上的錯義突變，其中T等位基因頻率非常低，蛋白預測結果表明該突變為無害突變(圖6A)，同時預測發現該突變對蛋白質的結構產生影響(圖6B)，推測其結構改變可能影響到奶牛的生產性能從而在育種選擇中被逐步淘汰。

表4 區域R2-2甲基化對產奶性狀的影響

Table 4 The effects of methylation status of region 2-2 CpG site on milk production traits

區域R2-2Region2-2乳脂率/%Fatpercentage乳蛋白率/%Proteinpercentage乳糖率/%Lactosepercentage未甲基化Unmethylation2.13±1.503.09±0.404.66±0.84甲基化Methylation2.35±2.193.15±0.504.75±1.05P值P-value0.520.440.59

mRNA水平分析表明，TRAPPC9基因表達量對乳脂率和乳糖率影響顯著，對乳蛋白率也有影響，同時發現SNP3位點對TRAPPC9基因表達量影響顯著，而SNP3不僅僅與產奶性狀關聯顯著，同時也與乳房炎抗性關聯顯著。相關研究[16]表明TRAPPC9基因的表達量對乳房炎抗性影響顯著，W.H.Hu等[22]報道TRAPPC9基因的過表達能夠增強TNF-α激活NF-κB信號通路。

TRAPPC9基因啟動子區甲基化狀態分析表明區域R1的甲基化效應等同于SNP1的效應，T.A.Dayeh等[23]對與2型糖尿病相關的16個基因的19個CpG-SNP進行研究，結果表明，這些SNP對2型糖尿病的效應可能通過這種差異的甲基化狀態所引起。區域R2的甲基化水平對奶牛的產奶性狀影響不顯著，相關研究[16,24]表明，該位點的甲基化水平對奶牛乳房炎抗性影響顯著。

本研究中區域R1的甲基化狀態由SNP1所決定，同時該位點為3個轉錄因子的結合位點，說明SNP1可能通過其對DNA甲基化產生影響，而DNA甲基化狀態的改變使DNA雙鏈的三維結構發生變化，阻止甲基化敏感的轉錄因子(包括NF-κB、ETS和E2F等)結合到DNA上發揮作用，同時，對甲基化不敏感的轉錄抑制因子會結合到DNA上，最終影響基因的表達，從而對表型產生影響[25-26]。 在人和小鼠上的大量研究[1,4-5]表明，TRAPPC9基因編碼的蛋白NIBP對激活NF-κB信號通路具有重要作用，在牛上僅有一例研究TRAPPC9基因的報道[27]，其研究表明TRAPPC9基因編碼的蛋白NIBP與牛病毒性腹瀉病毒蛋白互作調節NF-κB通路，而NF-κB信號通路在乳房炎的發生發展中發揮著重要的調控作用[28-30]，結合TRAPPC9基因的生物學功能，推測其可能通過對乳房炎抗性的影響間接影響到奶牛的產奶性狀。本研究中TRAPPC9基因SNP和mRNA表達水平對奶牛乳脂率影響極顯著，且SNP與前人GWAS研究報道一致。因此，可以考慮將其作為一個分子遺傳標記應用于中國荷斯坦牛的標記輔助選擇。

圖6 SNP2位點蛋白質預測結果Fig.6 Protein prediction of SNP2

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(編輯 郭云雁)

Confirming the Genetic Effects of BovineTRAPPC9 on Milk Production Traits Based on Post-GWAS Strategies

DONG Yi-chun，LIU Chao，WANG Xiao，WANG Ya-chun，ZHANG Yi，SUN Dong-xiao， ZHANG Sheng-li，ZHANG Qin，ZHANG Yuan，YU Ying*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

Based on the result of the previous genome-wide association study(GWAS) for milk production traits in Beijing Chinese Holstein population，trafficking protein particle complex 9(TRAPPC9) as a novel candidate gene for milk production traits was confirmed in new Chinese Holstein population.Promoter，exon and GWAS’s significant region was amplified and sequenced by screening the DNA pools to select single nucleotide polymorphisms(SNP) and analyze their association with milk production traits of Chinese Holstein population.The association analysis showed that the genotypes of SNP1 had significant effect on protein percentage(PP) and lactose percentge(LP)(P<0.01)；the genotypes of SNP2 had significant effect on PP and LP(P<0.05)；the genotypes of SNP3 had significant effect on fat percent(FP) and PP(P<0.01)；the genotypes of SNP4 had significant effect on FP(P<0.01)；the genotypes of SNP5 had significant effect on FP and LP(P<0.05).The expression ofTRAPPC9 also had significant effect on milk production traits，but the DNA methylation of promoter region ofTRAPPC9 had no direct effect.In conclusion，TRAPPC9 gene can be considered as a molecular marker applied to Chinese Holstein marker-assisted selection.

milk production trait；TRAPPC9 gene；SNP；DNA methylation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.008

2014-04-28

國家自然科學基金(31272420)；農業部奶業體系項目(CARS-37-04B)；十二五國家科技支持項目(2011BAD28B02)；“863”重大項目(2008AA101002)；教育部基本科研項目(2011JS006)；長江學者與創新團隊發展計劃(IRT1191)

董易春(1990-)，男，江蘇人，碩士生，主要從事動物分子數量遺傳學研究，E-mail：dongyichun.me@163.com

*通信作者：俞 英，副教授，博士生導師，主要從事動物分子抗病育種及表觀遺傳調控研究，E-mail：yuying@cau.edu.cn

S813.3；S823.91

A

0366-6964(2015)01-0060-09