牦牛乳腺上皮細胞體外培養及鑒定

陳亞冰，符 梅，蘭道亮，林寶山，黃 偲，李 鍵*

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041)

牦牛乳腺上皮細胞體外培養及鑒定

陳亞冰1，符 梅1，蘭道亮2，林寶山1，黃 偲1，李 鍵2*

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041)

本研究旨在建立牦牛乳腺上皮細胞系，并對建立的細胞系生物學特性進行鑒定,采用組織塊種植法，分離培養乳腺上皮細胞；通過胰酶消化法純化細胞；利用免疫熒光及Western blot技術對其進行鑒定；脂質體介導法將綠色熒光蛋白基因轉染進乳腺上皮細胞中，熒光顯微鏡下檢測綠色熒光蛋白基因表達；金黃色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮細胞，流式細胞儀(AnnexinV/PI 雙染法)檢測乳腺上皮細胞的凋亡，RT-PCR檢測感染細胞中抗菌肽以及凋亡因子表達。結果表明，分離純化獲得牦牛乳腺上皮細胞，細胞角蛋白18表達呈陽性，波形蛋白表達呈陰性，證明培養的細胞是上皮細胞并且沒有成纖維細胞污染；β-酪蛋白表達呈陽性，說明建立的乳腺上皮細胞具有一定的泌乳功能；熒光顯微鏡能夠檢測到綠色熒光蛋白表達，表明EGFP基因成功導入了乳腺上皮細胞；金黃色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮細胞3 h后， Annexin V/PI 雙染法檢測發現感染組細胞凋亡率明顯升高，差異顯著(P<0.05)；感染細胞中TAP(P<0.01)、BNBD5(P<0.01)及BAX(P<0.01)表達量明顯增高，BCL-2(P<0.05)表達量降低。綜上表明，本研究成功建立了一株穩定的牦牛乳腺上皮細胞系，該細胞系能夠作為研究牦牛乳腺發育及分化的體外研究模型。

牦牛；乳腺上皮細胞；培養；鑒定

保留乳腺特異性功能的乳腺上皮細胞系可以作為研究乳腺發育、分化以及乳腺生物反應器的理想模型[1-4]。牦牛(Bosgrunniens)是主要分布于海拔3 000 m以上青藏高原及其周邊高寒地區的物種，牦牛在藏區人民的日常生活中扮演著重要角色。與奶牛相比，牦牛年產奶量僅250 kg左右，但牦牛奶品質較高，干物質占到17.31%～18.40%。選擇性育種及現代飼養技術雖然能夠有助于提高牦牛的產奶量，但這種產量的增加是有限的。探究牦牛特殊泌乳機制能夠為提高牦牛泌乳量提供理論基礎，而牦牛乳腺上皮細胞系的建立可為研究牦牛泌乳調控機制提供理想的體外模型。在人[5]、鼠[6]、羊[7-8]、奶牛[9-10]、水牛[11-12]均已建立乳腺上皮細胞系，所建立的乳腺上皮細胞既可以用于研究乳蛋白基因表達及乳汁分泌機制，又可以作為研究干乳期細胞凋亡及乳腺退化的寶貴材料，同時還可以作為乳腺特異性表達載體的檢測系統，并用于評價乳腺特異性表達載體的有效及合理性[13]。由于物種的差異性，針對某種物種的乳腺上皮細胞生物學特性的研究并不能完全適用于其他物種，因此，牦牛乳腺上皮細胞系的建立對于研究牦牛乳腺生物學具有重要作用，也可以為構建基因組文庫、體細胞克隆及基因遺傳多樣性等研究提供理想生物學材料。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺組織采自成都市青白江屠宰場屠宰的泌乳后期健康牦牛。

1.2 主要試劑

EGFP-N1載體購自Promega公司；甘露醇培養基購自青島拓撲生物公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；FBS及胰酶購自GIBCO公司；Hochest 33342染料購自碧云天生物技術有限公司；DMEM/F12及青鏈霉素雙抗購自Hyclone公司；氫化可的松、胰島素、轉鐵蛋白、L-谷氨酰胺、EGF及孕酮購自Sigma公司；Trizol 購自Invitrogen 公司；cDNA反轉錄試劑盒購自Ferments 公司。

1.3 乳腺上皮細胞的分離培養及鑒定

剪取牦牛乳腺組織，切取少量乳腺組織塊，置于含有100 μg·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的DPBS中，于冰盒中迅速帶回實驗室。在超凈工作臺中去除脂肪及結締組織，用DPBS反復沖洗3～5遍，直到洗干凈為止。在含有微量培養液的培養皿中，將乳腺組織盡量剪成大小為1 mm3的組織塊。將組織塊接種到培養皿上，將培養皿置于37℃、體積分數為5% 的CO2培養箱中倒置培養4 h左右，盡量讓細胞貼壁，然后加入適量培養液，放回培養箱中培養。培養基每隔2 d 更換1次，待細胞基本長滿培養皿底壁，吸去原培養基，用DPBS清洗細胞3次，加入0.25%的胰酶，采用差時胰酶消化法分離純化獲得乳腺上皮細胞。

1.4 免疫熒光染色鑒別角蛋白18(Cytokeratin 18)及波形蛋白(Vimentin)

細胞免疫熒光染色鑒定細胞是否表達角蛋白18(上皮細胞標記蛋白)、波形蛋白(成纖維細胞標記蛋白)，從而驗證細胞是上皮細胞并檢驗是否被成纖維細胞污染。消化傳代的上皮細胞按每孔5×104個細胞接種于24孔板，待細胞鋪滿80%～90%時，吸去培養液，用DPBS洗滌2次； 4%多聚甲醛室溫固定30 min，DPBS沖洗細胞3次；用0.5%的Triton-100 通透處理細胞5 min，DPBS洗3次；1% BSA封閉 20 min，去除封閉液，甩干；加適量一抗，4 ℃過夜孵育；吸去一抗，DPBS沖洗3次，加入 FITC標記二抗，作用1 h，DPBS沖洗3次；Hochest33342避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5 Western-blot 檢測β-酪蛋白的表達

牦牛乳腺上皮細胞長到80%～90%豐度時，分成2組分別培養：一組加入誘導培養基(90% DMEM/F12+10% FBS+5 μg·mL-1胰島素+5 μg·mL-1孕酮+5 ng·mL-1表皮生長因子+1 μg·mL-1孕酮+5 μg·mL-1ITS+1 μg·mL-1氫化可的松+1 00 μg·mL-1青、鏈霉素 )；另一組只加入正常的生長培養基(90% DMEM/F12+10% FBS+1 00 μg·mL-1青、鏈霉素)。細胞培養后，根據Qiagen公司的蛋白質提取試劑盒說明書分別提取誘導組及非誘導組乳腺上皮細胞總蛋白質，提取總蛋白，Western blot檢測酪蛋白的表達，另外提取乳腺組織、成纖維細胞總蛋白分別作為陽性、陰性對照組。

1.6 EGFP-N1轉染牦牛乳腺上皮細胞

轉染前24 h，將牦牛乳腺上皮細胞以5×104個·mL-1密度接種于24孔板，每孔加入500 μL培養基(含血清及無抗生素)，待細胞長到80%匯合時，備用。轉染前2 h，細胞換液，加入無血清無雙抗DMEM培養基；將3 μL脂質體加入到50 μL DMEM/F12中稀釋，溫和混勻，室溫作用5 min；將 1 μg質粒加入到50 μL DMEM/F12中稀釋，室溫作用5 min；混合稀釋的質粒和脂質體，室溫靜置20 min，形成DNA-脂質體混合物；將混合液加到24孔板中，4 h后換用完全培養基繼續培養；24 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況，加入G418對轉染的細胞進行篩選。

1.7 金黃色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮細胞

金黃色葡萄球菌(ATCC29525)于甘露醇培養基中劃線并37 ℃過夜培養，挑取單菌落于甘露醇肉湯培養基中擴大培養12 h，3 000 r·min-1，離心5 min收集菌體，收集的菌體用DMEM/F12重懸。將重懸的菌體以MOI=100∶1的比例接種于生長至85% 的乳腺上皮細胞中侵染3 h，同時設置以不被菌體感染細胞作為對照組。

1.7.1 金黃色葡萄球菌誘導牦牛乳腺上皮細胞凋亡檢測 采用 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，具體流程：侵染試驗完成后，收集上清至 15 mL 離心管中；胰蛋白酶消化貼壁細胞成單個細胞懸液；1 000 r·min-1離心 3 min，收集消化的細胞并與上清中的細胞合并。調整細胞密度達到1×106個·mL-1，取100 μL細胞懸液，分別加入5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，室溫下避光孵育 15 min，1 h 內流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7.2 定量PCR檢測抗菌肽及凋亡因子表達 細胞侵染3 h后移除培養液，DPBS洗2次，向培養皿中加入Trizol提取細胞總RNA，反轉錄獲得的cDNA于-20 ℃保存備用。采用熒光定量PCR檢測抗菌肽、凋亡因子在細胞中的表達量。定量引物序列見表1，其中定量PCR反應體系為15 μL：SYBR Premix Ex TaqTM II 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1 μL，dH2O 5.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，39個循環，添加熔解曲線；每個組織樣品進行3個重復，GAPDH基因被選用作為內參基因。

表1TAP、BNBD5、BAX及BCL-2基因定量引物序列

Table 1 RT-PCR primers used in this study forTAP，BNBD5，BAX，andBCL-2 genes

基因Genes引物序列(5'-3')Sequencesofprimers退火溫度/℃Theannealingtemperature擴增片段長度/bpLengthofamplifiedfragmentTAPCTCCATCACCTGCTCCTCGGCCCAACACAGGTGCCAA58.5160BNBD5GCCAGCATGAGGCTCCATCTTGCCAGGGCACGAGATCG58143BAXTGGACATTGGACTTCCTTCGTGAGCACTCCAGCCACAAAG58100BCL-2AGGGACGGGGTGAACTGGCATACAGCTCCACAAGG60193GAPDHGCTGGTGCTGAGTAGTTGGTGTCTTCTGGGTGGCAGTGATGG60220

熒光定量結果采用相對定量的2-△△CT法進行數據分析，并用Spass 18.0軟件進行數據處理。

2 結 果

2.1 牦牛乳腺上皮細胞培養及鑒定

2.1.1 牦牛乳腺上皮細胞的分離培養 組織塊接種7 d后，可見有成纖維細胞從組織塊中游離出來(圖1A)，繼續培養10 d以后，有上皮細胞長出來(圖1B)。胰酶差時消化獲得成纖維細胞及乳腺上皮細胞，獲得的成纖維細胞成扁纖維狀結構(圖1C)，純化后的上皮細胞呈多種形態，當細胞密度比較低的時候，乳腺上皮細胞呈島嶼狀生長(圖1D)，細胞長到匯集到80%時呈現鵝卵石形(圖1E)，此時不傳代，讓細胞繼續生長到單層細胞鋪滿時會看到細胞呈現不規則多角形(圖1F)。當培養基加入誘導因子后，乳腺上皮細胞周邊會出現乳滴(圖1G)，乳滴不斷向外分泌形成維管狀(圖1H)。該細胞能夠連續傳代60代以上，并且細胞形態沒有發生變化，經液氮泠凍保存復蘇后的細胞仍保持正常細胞形態(圖1I)。

2.1.2 Western blot檢測牦牛乳腺上皮細胞的乳蛋白表達 采用Western blot技術探測β-酪蛋白表達，結果顯示,建立的牦牛乳腺上皮系具有合成牛奶蛋白的能力，另外，培養基中添加的誘導因子能夠增強乳腺上皮細胞分泌乳蛋白能力(圖2)。

A.組織塊周圍游離出成纖維細胞；B.乳腺上皮細胞長出；C.純化后的成纖維細胞；D.上皮細胞呈現島狀；E.上皮細胞呈現鵝卵石形；F.上皮細胞呈不規則多角形；G.乳腺上皮細胞分泌出乳滴；H.腔狀結構出現；I:復蘇細胞A.Fibroblasts elongated from tissues；B.Growth of mammary epithelial cells；C.Purification of fibroblasts；D.Yak mammary epithelial cells formed islands；E.Oval morphology of yak mammary epithelial cells；F.Irregular polygon morphology of yak mammary epithelial cells；G.Yak mammary epithelial cells contained milk drops；H.Tubular structure；I.Morphology of resuscitated yak mammary epithelial cells圖1 牦牛乳腺上皮細胞的各種形態Fig.1 The morphology of yak mammary epithelial cells

1.牦牛乳腺組織；2.成纖維細胞；3.牦牛乳腺上皮細胞(基礎培養基);4.牦牛乳腺上皮細胞(誘導培養基)1.Mammary gland tissue of yak；2.Fibroblasts；3.Yak mammary epithelial cells cultured in basmal medium；4.Yak mammary epithelial cells cultured in induction medium圖2 Western blot鑒定β-casein表達Fig.2 The identification of β-casein by Western blot

2.1.3 牦牛乳腺上皮細胞的免疫熒光鑒定 應用細胞免疫熒光染色的方法檢測了乳腺上皮細胞Cytokeratin 18及Vimentin蛋白表達，倒置熒光顯微鏡觀察結果，結果顯示該細胞表達Cytokeratin 18蛋白(圖3)，Vimentin蛋白呈陰性(圖3)，進一步在蛋白水平上驗證培養的細胞是乳腺上皮細胞，并沒有成纖維細胞污染。

2.2 EGFP-N1轉染牦牛乳腺上皮細胞

牦牛乳腺上皮細胞轉染EGFP-N1 12 h后，可見部分細胞發綠色熒光，分布較散，且熒光比較弱(圖4A)。24 h后陽性細胞明顯增多，低倍鏡下看到轉染效率有30%左右，經G418篩選(600 μg·mL-1)，第3 天大量細胞開始死亡，10 d后可看到有單克隆細胞產生(圖4B)，大約14 d，未轉染的細胞在G418作用下全部死亡，此時G418濃度減半(300 μg·mL-1)繼續篩選培養，待細胞鋪滿單層后擴大培養(圖4C)。

A.Cytokeratin 18蛋白免疫熒光圖；B.細胞核免疫熒光圖；C.Cytokeratin 18蛋白與細胞核免疫圖合并；D.Vimentin蛋白免疫熒光圖；E.細胞核免疫熒光圖；F.Vimentin蛋白與細胞核免疫圖合并A.Fluorecent image of cells incubated with anti-cytokeratin 18 antibody；B.Fluorecent image of cell nucleus；C.Mergence of fluorescent images of cytokeratin 18 and cell nucleus；D.Fluorecent image of cells incubated with vimentin antibody；E.Fluorecent image of cell nucleus；F.Mergence of fluorescent images of vimentin and cell nucleus圖3 免疫熒光鑒定角蛋白8及角蛋白18 400×Fig.3 The immunofluorescence assay of cytokeratin 8 and cytokeratin 18 400×

A.陽性細胞表達綠色熒光蛋白；B.G418篩選后陽性單克隆細胞；C.鋪滿平板陽性細胞A.Positive cell expressing the EGFP；B.The positive monoclonal cells after G418 screening；C.The positive cells overspreading the plate圖4 綠色熒光蛋白在牦牛上皮細胞系中表達Fig.4 The expression of EGFP in yak mammary epithelial cell

2.3 金黃色葡萄球菌誘導牦牛乳腺上皮細胞的凋亡檢測

2.3.1 普通光學顯微鏡下觀察侵染后細胞凋亡情況 金黃色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮細胞3 h后，顯微鏡下可看到對照組細胞形態完好，細胞與細胞之間的連接緊密；ATCC29525感染的上皮細胞有脫落現象，且細胞與細胞之間的連接松散，細胞有皺縮的趨勢，但細胞膜完整。

2.3.2 流式細胞儀檢測乳腺上皮細胞凋亡結果 為了進一步證明金黃色葡萄球菌可以誘導乳腺上皮細胞凋亡，采用流式細胞儀(AnnexinV/PI雙染法)檢測細胞凋亡情況。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此活細胞不被染色，早期凋亡的細胞僅被Annexin-FITC染色，晚期凋亡細胞可被Annexin/PI雙染色。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限是凋亡晚期細胞和壞死細胞。結果顯示(圖5)，與對照組相比，金黃色葡萄球菌感染后的上皮細胞在早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯高于對照組，凋亡率差異顯著(P<0.05)。

B1.壞死細胞；B2.繼發性壞死細胞；B3.活細胞；B4.早期凋亡細胞B1.Necrotic cells；B2.Secondary necrotic cells；B3.Viable cells；B4.Early apoptotic cells圖5 AnnexinV/PI 雙染法分析細胞凋亡Fig.5 Analysis of apoptosis cell by AnnexinV/PI

2.3.3 抗菌肽及凋亡因子基因表達量檢測分析

采用熒光定量PCR技術檢測金黃色葡萄球菌感染乳腺上皮細胞前后抗菌TAP、BNBD5基因及凋亡因子BAX、BCL-2基因表達量變化。結果顯示(圖6)，感染組細胞BNBD5及TAP基因表達量高于對照組(P<0.01)；感染組細胞BAX基因表達量高于對照組(P<0.01)，而BCL-2基因表達量低于對照組(P<0.05)。

CG.對照組；S.aureus treated.金黃色葡萄球菌侵染組；*.P<0.05;**.P<0.01CG.Control group；S.aureus treated.The cells infected by S.aureus；*.P<0.05；**.P<0.01圖6 目的基因RT-PCR定量結果Fig.6 The relative expression of related genes

3 討 論

3.1 牦牛乳腺上皮細胞的培養及鑒定

有泌乳功能的乳腺上皮細胞系不僅可以用來研究乳蛋白基因表達及泌乳機制，還可通過轉基因技術改變乳汁的成分，獲得具有生物活性成分的重要外源產物[13]，但通過乳腺生物反應器生產能達到商品化生產所需的為數不多。因此，本研究建立正常乳腺上皮細胞培養體系，為進一步研究上皮細胞的增殖和分化以及乳腺生物反應器提供合適的細胞平臺。

動物細胞原代培養主要有兩種方法，一是組織塊培養法，即從貼壁的組織塊周圍長出細胞，此種方法耗時長，但容易得到較純的乳腺上皮細胞，已被證明適用于乳腺上皮細胞的原代培養；二是膠原酶消化法收集單細胞懸液，此種方法獲得乳腺上皮細胞的時間短，但上皮細胞與成纖維細胞夾雜生長，不利于乳腺上皮細胞的純化[14-15]。因此，本研究采用組織塊培養法培養牦牛乳腺上皮細胞。細胞角蛋白18是上皮細胞的特異性標記蛋白，波形蛋白是成纖維細胞特異標記蛋白，細胞免疫熒光結果顯示純化的細胞為牦牛乳腺上皮細胞。在體外，一些激素已被證明能影響乳腺上皮細胞的增殖及誘導乳腺上皮細胞分泌乳汁。表皮生長因子(EGF)對細胞具有很強的促分裂活性和促生長作用[16]，胰島素能增加乳腺上皮細胞的貼壁率和伸展[16]，氫化可的松對維持乳腺上皮細胞的生長也是必需的[17]。本研究選用含10%的胎牛血清、5 μg·mL-1的胰島素、5 μg·mL-1EGF、1 μg·mL-1氫化可的松、100 μg·mL-1青鏈霉素的DMEM-F12培養液，細胞活力旺盛，生長良好，能夠傳至60代以上，說明此培養液適合乳腺上皮細胞的生長。β-酪蛋白的合成與分泌是功能性乳腺上皮細胞體外成功的標志，Western blot檢測發現培養的乳腺上皮細胞能夠分泌酪蛋白，證明培養的牦牛乳腺上皮細胞具有分泌乳汁能力。

3.2 牦牛乳腺上皮細胞轉染EGFP-N1

小鼠曾被選作構建乳腺特異性表達載體的模式動物，但小鼠乳腺上皮細胞分泌的乳汁量有限，而牛與羊分泌的乳汁量較多，因此，牛羊乳腺上皮細胞可被選作乳腺生物反應器[18-19]。本研究采用EGFP-N1質粒轉染牦牛乳腺上皮細胞檢測轉染效率，轉染效率達到30%，說明牦牛乳腺上皮細胞具有整合外源基因的能力，可作為表達外源基因的生物反應器。

3.3 金黃色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮細胞的凋亡

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，奶牛乳房炎可導致牛奶質量、產量下降從而造成嚴重的經濟損失。目前，由金黃色葡萄球菌感染引起的牛乳房炎的致病機制尚不清楚，因此對發病機理的研究將是解決上述問題關鍵。本研究發現金黃色葡萄球菌感染牦牛乳房上皮細胞能夠誘導細胞表達抗菌肽TAP及BNBD5，這與前人研究結果一致[20-21]。BAX和BCL-2分別作為凋亡因子及抗凋亡因子，其相對表達量調控細胞對凋亡刺激不同反應，即誘導或抑制凋亡。結果顯示，金黃色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮細胞后，BAX基因表達升高，BCL-2基因表達量降低。流式細胞儀檢測感染前后細胞凋亡情況，結果顯示感染后的細胞具有較高的凋亡率。崔新潔等[22]采用金黃色葡萄球菌感染了牛乳腺上皮細胞，感染后的牛乳腺上皮細胞呈現了細胞核皺縮，染色質邊緣化和細胞漿內空泡增多等典型凋亡特征，研究并證明了金黃色葡萄球菌能夠誘導牛乳腺上皮細胞凋亡，并推測凋亡通路可能涉及 Caspase 3 和 Caspase 8 參與的外源性凋亡途徑[22-23]。本研究建立的乳房上皮細胞能夠用于金黃色葡萄球菌侵染研究，為下一步研究牦牛乳房炎提供了一個良好的體外研究模型。

4 結 論

本研究成功建立了一株穩定的牦牛乳房上皮細胞系，該細胞系保留了乳房上皮細胞系的典型細胞特征，暗示了該細胞系能夠作為研究牦牛乳腺發育及分化的體外研究模型。

[1] SUN Y L，LIN C S，CHOU Y C.Establishment and characterization of a spontaneously immortalized porcine mammary epithelial cell line [J].CellBiolInt，2006，30(12)：970-976.

[2] SHI H，LUO J，WANG W，et al.Establishment and characterization of a dairy goat mammary epithelial cell line with human telomerase(hT-MECs) [J].AnimSciJ，2014，85(7)：735-743.

[3] TONG H L，LI Q Z，GAO X J，et al.Establishment and characterization of a lactating dairy goat mammary gland epithelial cell line [J].InvitroCellDevBiolAnim，2012，48(3)：149-155.

[4] ZHAO K，LIU H Y，ZHOU M M，et al.Establishment and characterization of a lactating bovine mammary epithelial cell model for the study of milk synthesis [J].CellBiolInt，2010，34(7)：717-721.

[5] GAFFNEV E V，POLANOWSKI F，BLACKBURN S E，et al.Cultures of normal human mammary cells [J].CellDiffer，1976，5(2)：69-81.

[6] YANG J，RICHARDS J，GUZMAN R，et al.Sustained growth in primary culture of normal mammary epithelial cells embedded in collagen gels [J].ProcNatlAcadSciUSA，1980，77(4)：2088-2092.

[7] PANTSCHENKO A G，WOODCOCK-MITCHELL J，BUSHMICH S L，et al.Establishment and characterization of a caprine mammary epithelial cell line(CMEC) [J].InvitroCellDevBiolAnim，2000，36(1)：26-37.

[8] KE M W，HSU J T，JIANG Y N，et al.Characterization of hTERT-immortalized caprine mammary epithelial cells [J].ReprodDomestAnim，2012，47(4)：553-561.

[9] HU H，WANG J，BU D，et al.Invitroculture and characterization of a mammary epithelial cell line from Chinese Holstein dairy cow [J].PLoSONE，2009，4(11)：e7636.

[10] JEDRZEJCZAK M，SZATKOWSKA I.Bovine mammary epithelial cell cultures for the study of mammary gland functions [J].InvitroCellDevBiolAnim，2014，50：389-398.

[11] ANAND V，DOGRA N，SINGH S，et al.Establishment and characterization of a buffalo(Bubalusbubalis) mammary epithelial cell line [J].PLoSONE，2012，7(7)：e40469.

[12] KAUSHIK R，SINGH K P，KUMARI A，et al.Isolation，characterization，and EGFP expression in the buffalo(Bubalusbubalis) mammary gland epithelial cell line[J].InvitroCellDevBiolAnim，2013，49(1)：1-7.

[13] WHEELER T T，CALLAGHAN M R，DAVIS S R，et al.Milk protein synthesis，gene expression，and hormonal responsiveness in primary cultures of mammary cells from lactating sheep [J].ExpCellRes，1995，217(2)：346-354.

[14] 王 楨，羅 軍，王 偉，等.奶山羊乳腺上皮細胞的分離、培養及鑒定 [J].生物工程學報，2010，26(8)：1123-1127. WANG Z，LUO J，WANG W,et al.Characterization and culture of isolated primary dairy goat mammary gland epithelial cells[J].ChineseJournalofBiotechnology，2010，26(8)：1123-1127.(in Chinese)

[15] 陳建暉，佟慧麗，李慶章，等.奶牛乳腺上皮細胞系的建立 [J].畜牧獸醫學報，2009，40(5)：743-747. CHEN J H,TONG H L,LI Q Z,et al.Establishment of dairy cow mammary gland epithelial cell line [J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2009，40(5)：743-747.(in Chinese)

[16] AKERS R M.Major advances associated with hormone and growth factor regulation of mammary growth and lactation in dairy cows [J].JDairySci，2006，89(4)：1222-1234.

[17] PUISSANT C，ATTAL J，HOUDEBINE L M.The hormonal control of ovine beta-lactoglobulin gene in cultured ewe mammary explants [J].ReprodNutrDev,1990,30(2)：245-251.

[18] WHEELER M B，WALTERS E M.Transgenic technology and applications in swine [J].Theriogenology，2001,56(8)：1345-1369.

[19] KUMURA H，TANAKA A，ABO Y，et al.Primary culture of porcine mammary epithelial cells as a model system for evaluation of milk protein expression [J].BiosciBiotechnolBiochem，2001，65(9)：2098-2101.

[20] YANG Z T，FU Y H，LIU B，et al.Farrerol regulates antimicrobial peptide expression and reduces Staphylococcus aureus internalization into bovine mammary epithelial cells[J].MicrobPathog，2013，65:1-6.

[21] WEI Z K，FU Y H，ZHOU E S，et al.Effects of niacin on Staphylococcus aureus internalization into bovine mammary epithelial cells by modulating NF-kB activation[J].MicrobPathog，2014,(71-72)：62-67.

[22] 崔新潔，胡慶亮，李奕平，等.金黃色葡萄球菌誘導牛原代乳腺上皮細胞的凋亡[J].中國農業科學，2013，46(15)：3212-3219. CUI X J，HU Q L，LI Y P，et al.The apoptosis of bovine primary mammary epithelial cells induced byStaphylococcusaureus[J].ScientiaAgriculturaSinica，2013，46(15)：3212-3219.(in Chinese)

[23] HU Q，CUI X，TAO L，et al.Staphylococcusaureusinduces apoptosis in primary bovine mammary epithelial cells through Fas-FADD death receptor-linked caspase-8 signaling[J].DNACellBiol，2014，33(6)：388-397.

(編輯 程金華)

Culture and Identification of Yak Mammary Epithelial Cells

CHEN Ya-bing1，FU Mei1，LAN Dao-liang2，LIN Bao-shan1，HUANG Cai1，LI Jian2*

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041,China； 2.CollegeofTibetanPlateauResearch，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041,China)

The present study was carried out to establish yak mammary epithelial cell (YMEC) line and identify its biological characteristic，which was separated using tissue explants method，purified by selective trypsinization，characterized by immunofluorescence and Western blot assay.TransfectingEGFP-N1 gene into cells using lipofection to examine whether foreign genes could be transfected into YMECs，fluorescence microscope was used to detect the expression ofEGFPgene.Lastly，flow cytometry was used to evaluate the apoptosis level of cells with Annexin V/PI double staining and RT-PCR was used to examine gene expression of antibacterial peptide and apoptosis factors to determine the effect ofStaphylococcusaureusinfection on YMECs.Immunofluorescence assay results proved established cell line could express cytokeratin 18 rather than vimentin，indicating no fibroblast existing in epithelial cells.Positive expression of β-casein in YMECs demonstrated cultured cells could synthesize and secrete mammary- specific milk protein.Moreover，we detected EGFP protein in transfected YMECs by fluorescence microscope，showingEGFPgene was successfully transfected into the YMECs.After YMECs were challenged with forStaphylococcusaureusfor 3 h，the apoptosis level of mammary epithelial cells was significantly up-regulated(P<0.05).Furthermore，the expression ofTAP(P<0.01)，BNBD5(P<0.01)andBAX(P<0.01)genes increased; whereas that ofBCL-2 gene decreased(P<0.05).To conclude，we successfully established a stable yak mammary epithelial cell line，which can be used as a useful modelinvitrofor study of yak mammary gland development and differentiation.

yak；mammary epithelial cells；culture；characterization

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.009

2014-07-31

國家公益行業(農業)科研專項(201203009)

陳亞冰(1989-)，男，河南許昌人，碩士生，主要從事動物免疫機制研究，E-mail: xccyb 916@163.com

*通信作者：李 鍵，教授，博士，主要從事牦牛育種研究，E-mail: lijian@swun.cn

S823.8+5；S813

A

0366-6964(2015)01-0069-08