臨床相關(guān)劑量參附注射液預(yù)處理和后處理對(duì)大鼠腸缺血再灌注致急性肺損傷的影響

劉志剛，劉永芳，胡 剛，謝恒濤

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北武漢 430060)

胃腸道參與休克及多器官功能不全綜合征(MODS)的病理生理過程，腸缺血再灌注期間胃腸道及遠(yuǎn)隔臟器損傷的保護(hù)是臨床多學(xué)科研究的熱點(diǎn)。其中以急性肺損傷引起的急性呼吸窘迫綜合癥尤為突出［1－3]。參附注射液 (shenfu injection，SFI)已應(yīng)用于休克和多器官功能不全綜合征的防治，尤其是胃腸道和肺損傷的保護(hù)，近年研究發(fā)現(xiàn)參附注射液可改善油酸所致的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的血流動(dòng)力學(xué)、肺及血液的氧合功能，對(duì)肺損傷具有一定的保護(hù)和治療作用［4－6]。本研究探討臨床相關(guān)等效劑量參附注射液預(yù)處理和后處理對(duì)腸缺血再灌注損傷所致的急性肺損傷的影響。

1 材料與方法

1．1 藥品和試劑 參附注射液購自吉林卓怡康納制藥有限公司，每支60 mg，批號(hào)050301;氯化高鐵血紅素(Hemin)，Sigma公司;兔抗人HO-1多克隆抗體，武漢博士德生物工程公司;免疫組化SABC、SOD、MDA試劑盒(Santa Cruz公司)。

1．2 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠56只，體重200～260 g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):00012298)。隨機(jī)分成7組(n=8)，即對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、參附注射液預(yù)處理組(SFPR組)、參附注射液后處理組(SFPO組)、血晶素組(Hemin組)、鋅原卟啉IX+SFPR組(ZnPPIX+SFPR組)、鋅原卟啉IX+SFPO組。

1．3 方法 實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。稱重，10%水合氯醛4 mg·kg－1腹腔麻醉后固定。參照Koji Ito等［7]的方法復(fù)制腸I/R模型，腹部正中脫毛，消毒鋪巾，正中切口進(jìn)腹，分離腸系膜上動(dòng)脈，在其根部用一個(gè)套硅膠管小動(dòng)脈夾鉗夾，觀察2 min，確定腸系膜上動(dòng)脈血流被阻斷后，腸壁蒼白，血管無搏動(dòng)，縫合傷口。1 h后經(jīng)原切口進(jìn)腹，松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)血供。整個(gè)手術(shù)過程中，于腹腔內(nèi)滴加溫?zé)?7℃生理鹽水維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境平衡。對(duì)照組同樣開腹，但不鉗夾血管，僅輕擾腹腔后關(guān)腹。各組動(dòng)物于再灌注2 h后頸動(dòng)脈放血處死。

1．4 觀察指標(biāo)與方法

1．4．1 SABC免疫組化方法檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá) 采用免疫組化染色，以肺組織切片細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀沉淀物為陽性細(xì)胞。采用HIPAS-2000型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，對(duì)HO-1的蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析，在顯微鏡下對(duì)陽性染色進(jìn)行分析，測(cè)定HO-1平均吸光度(OD)，隨機(jī)測(cè)定5個(gè)高倍視野后計(jì)算其平均值。

1．4．2 血?dú)夥治鰷y(cè)定 大鼠處死前右頸動(dòng)脈采血1 mL抗凝行血?dú)夥治觥０匆髮⒀禾畛涞脚ci-STAT血?dú)夥治鰞x配套的血?dú)夥治鰷y(cè)試片加樣池中，避免氣泡產(chǎn)生，將測(cè)試片插入自動(dòng)血?dú)夥治鰞x，讀取PaO2和PaCO2數(shù)值。

1．4．3 肺通透性指數(shù)測(cè)定 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白濃度與血清中蛋白濃度之比，即為肺通透性指數(shù)，指數(shù)增大說明肺毛細(xì)血管通透性增加，它是評(píng)價(jià)肺損傷的指標(biāo)［8]。

采用考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定法測(cè)支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量。

1．4．4 肺組織 MDA、SOD含量測(cè)定 取右肺中葉100 mg(濕重)，以硫代巴比妥酸法測(cè)MDA，以黃嘌呤氧化酶法測(cè)SOD。

1．4．5 分析天平測(cè)量肺組織濕/干重比(wet weight to dry weight ratio，W/D) 取左肺部分組織，濾紙吸干表面附著水分，用分析天平準(zhǔn)確測(cè)量濕重并記錄，于80℃恒溫箱烤24 h至肺干重恒定，稱干重，計(jì)算W/D。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x±s)示，采用SPSS13．0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 參附注射液對(duì)肺組織HO-1表達(dá)的影響 與C組比較，I/R組、SFPR組、SFPO組和Heim組肺組織HO-1細(xì)胞陽性表達(dá)增高;與I/R組比較，SFPR組、SFPO組和Heim組肺組織HO-1細(xì)胞陽性表達(dá)增高;ZnPPIX+SFPR組和ZnPPIX+SFPO組上述陽性細(xì)胞表達(dá)降低(P＜0．05)。見表1。

2．2 參附注射液對(duì)肺通透性指數(shù)和肺組織MDA、SOD含量的影響 I/R組肺通透性指數(shù)與肺組織MDA含量明顯高于C組，而SOD含量顯著降低(P＜0．05);與I/R組比較，SFPR組、SFPO組和Heim組肺通透性指數(shù)、肺組織MDA含量均顯著降低，SOD 值明顯升高(P ＜0．05或 P ＜0．01)，ZnPPIX+SFPR組和ZnPPIX+SFPO組與I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見表1。

2．3 參附注射液對(duì)大鼠肺組織濕/干重比的影響與C組相比，I/R組肺組織濕/干重比增高50%(P＜0．05)，SFPR組、SFPO組和Heim組較I/R組分別降低17．4%、13．4% 和 18．6%(P ＜ 0．05)，但仍高于 C組(P＜0．05);ZnPPIX+SFPR組和 Zn-PPIX+SFPO組與I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見表2。

表1 參附注射液對(duì)肺組織HO-1(OD)和MDA、SOD含量表達(dá)的影響(x ± s，n=8)

表2 參附注射液對(duì)肺通透性指數(shù)和肺組織濕/干重比的影響(x ± s，n=8)

2．4 參附注射液對(duì)動(dòng)脈血?dú)獾挠绊?各組動(dòng)物動(dòng)脈血pH值相近，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠缺血再灌注后，PaO2、PaCO2較 C 組顯著下降(P ＜0．05)。SFPR組、SFPO組和Heim組PaO2、PaCO2明顯高于I/R組，ZnPPIX+SFPR組和ZnPPIX+SFPO組與I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見表3。

3 討論

腸缺血/再灌注損傷是臨床上一種很常見且非常重要的臨床現(xiàn)象，研究表明，腸缺血再灌注損傷不僅加重腸道損傷，而且造成腸外多種器官損傷，如肺、心、腎、肝功能受損，甚至出現(xiàn)多臟器功能障礙綜合征(MODS)。肺臟是最易受損的器官，急性肺損傷(ALI)是MODS發(fā)展中出現(xiàn)最早、發(fā)生率最高的臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)［9－10]。所以腸缺血再灌注引起的急性肺損傷倍受關(guān)注。

表3 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治霰容^(x ± s，n=8)

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠腸缺血1 h再灌注2 h可引起典型的急性肺損傷病理表現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道［11－13]，腸缺血再灌注后，氧自由基造成的損害可能為重要的病理機(jī)制，并在腸缺血再灌注后的肺損傷中起重要作用;本研究的結(jié)果與之一致，腸缺血再灌注后，肺組織中SOD活性明顯降低，MDA含量顯著增高，與對(duì)照組相比差異非常顯著，提示腸缺血再灌注后產(chǎn)生的氧自由基對(duì)肺血管內(nèi)皮和肺泡細(xì)胞膜產(chǎn)生了明顯損傷。

參附注射液作為一種傳統(tǒng)的中藥，具有穩(wěn)定的強(qiáng)心升壓作用，改善微循環(huán)，防治臟器缺血—再灌注損傷，主要應(yīng)用于創(chuàng)傷、休克及危重病患者的急救;參附采用10 mL·kg－1是根據(jù)臨床使用后換算而來的相關(guān)劑量［14－15]。

本研究發(fā)現(xiàn):缺血再灌注組肺內(nèi)組織HO-1表達(dá)增加，肺組織中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，氧和指數(shù)顯著降低，肺組織出現(xiàn)典型的病理特征;當(dāng)預(yù)防性的給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液和腹腔注射血紅素加氧酶的誘導(dǎo)劑血晶素(Hemin)時(shí)，肺內(nèi) HO-1表達(dá)均明顯增強(qiáng)，肺組織中MDA含量相應(yīng)降低，而SOD活性顯著增高，肺氧和指數(shù)明顯改善。組織病理學(xué)改變減輕:肺組織病理變化在參附注射液預(yù)防組僅見部分肺泡及血管壁周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷程度較缺血再灌注組明顯減輕。結(jié)果表明預(yù)防性應(yīng)用臨床相關(guān)劑量的參附注射液對(duì)腸缺血再灌注導(dǎo)致的急性肺損傷有明顯的保護(hù)作用，當(dāng)腹腔注射血紅素加氧酶的抑制劑鋅原卟啉IX(ZnPPIX)時(shí)，盡管在缺血前預(yù)防性的給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液，但各項(xiàng)指標(biāo)與I/R組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，其保護(hù)作用不再呈現(xiàn)。提示SFI預(yù)處理對(duì)IIR肺損傷的保護(hù)作用可能與誘導(dǎo)HO-1的肺內(nèi)高表達(dá)有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn):當(dāng)治療性的給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液和腹腔注射血紅素加氧酶的誘導(dǎo)劑血晶素(Hemin)時(shí)，肺內(nèi)HO-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，肺組織中MDA含量相應(yīng)降低，而SOD活性顯著增高，肺氧合指數(shù)明顯改善。組織病理學(xué)改變減輕，結(jié)果表明治療性應(yīng)用臨床相關(guān)劑量的參附注射液對(duì)腸缺血再灌注導(dǎo)致的急性肺損傷也有明顯的保護(hù)作用，當(dāng)腹腔注射血紅素加氧酶的抑制劑鋅原卟啉IX(ZnPPIX)時(shí)，盡管在再灌注前治療性的給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液，但各項(xiàng)指標(biāo)與I/R組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，其保護(hù)作用不再呈現(xiàn)。提示SFI后處理對(duì)IIR肺損傷的保護(hù)作用也可能與誘導(dǎo)HO-1的肺內(nèi)高表達(dá)有關(guān)。

因此，臨床相關(guān)劑量的參附注射液預(yù)處理和后處理均減輕了肺組織的病理損傷，從而改善肺功能，提高機(jī)體氧輸送能力，改善機(jī)體缺氧狀態(tài)，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。其共同機(jī)制可能與上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)、一定程度上抑制脂質(zhì)過氧化、拮抗氧自由基的損傷有關(guān)，但其保護(hù)作用的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

［1] 郭海峰，岳 輝，李鐵靈．p38MAPK抑制劑對(duì)重癥胰腺炎大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用［J]．安徽醫(yī)藥，2014，18(6):1034－1037．

［2] 司瑞超，蔡春玲，任原貞．肺與大腸相表里理論在治療咳嗽中的應(yīng)用［J]．河南中醫(yī)，2014，34(11):2244．

［3] Guan YF，Pritts TA，Montrose MH．Ischemic post-conditioning to counteract intestinal ischemia/reperfusion injury［J]．World JGastrointest Pathophysiol，2010，1(4):137 － 143．

［3] 吉其艦，燕憲亮，趙寧軍，等．黃芩苷預(yù)處理對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用［J]．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥，2014，16(9):31－34．

［4] 石亮亮，劉明東，朱 浩，等．丹參酮IIA磺酸鈉對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的抗炎作用及其機(jī)制研究［J]．胃腸病學(xué)，2014，19(6):332 －335．

［5] 劉華琴，邢玉英，全 彤，等．丙泊酚復(fù)合烏司他丁對(duì)大鼠腸缺血再灌注致急性肺損傷的影響［J]．中國(guó)老年學(xué)，2010，30(5):1376－1378．

［6] Park YY．Ischemia/reperfusion Lung Injury Increases Serum Ferritin and Heme Oxygenase － 1 in Rats［J]．Korean JPhysiol Pharmacol，2009，13(3):181 －187．

［7] Ito K，Ozasa H，Kojima N，et al．Pharmacological preconditioning protects lung injury induced by intestinal ischemial/reperfusion in rat［J]．Shock，2003，19(5):462 －468．

［8] 劉 東，汪惠文，耿智隆，等．血紅素氧合酶－1在遠(yuǎn)隔肢體缺血預(yù)處理減輕兔肺缺血再灌注損傷中的作用［J]．中華麻醉學(xué)，2014，34(2):219 －222．

［9] Namba F，Go H，Murphy JA，et al．Expression level and subcellular localization of heme oxygenase-1 modulates its cytoprotective properties in response to lung injury:a mouse model［J]．PLoS One，2014，9(3):51 －57．

［10] Santos CH，Gomes OM，Pontes JC，et al．The ischemic preconditioning and postconditioning effect on the intestinal mucosa of rats undergoing mesenteric ischemia/reperfusion procedure［J]．Acta Cir Bras，2008，23(1):22 －28．

［11]成國(guó)哲，吳曉本，劉景磊，等．姜黃素對(duì)大鼠移植肝缺血再灌注損傷指標(biāo)血紅素氧合酶－1表達(dá)的影響［J]．中華實(shí)驗(yàn)外科，2015，32(1):193 －194．

［12]孟慶濤，江 瑩，孫 倩．缺血后處理對(duì)小鼠腸缺血再灌注所致急性肺損傷保護(hù)作用中炎癥介質(zhì)的影響［J]．武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，33(4):487 －490．

［13]王艷蕾，崔國(guó)金，蔡慶艷，等．參麥注射液對(duì)腸缺血再灌注肺脂質(zhì)過氧化損傷的影響［J]．天津醫(yī)藥，2010，38(11):986 －989．

［14]徐 睿，李啟芳，姜 虹．抑制低氧誘導(dǎo)因子－1α表達(dá)對(duì)小鼠腸缺血再灌注所致肺損傷的影響［J]．國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇，2013，34(11):986 －989．