清熱解肌顆粒中揮發油的初步質量研究

劉 雪，崔 穎，黃順旺，王 浩，陳師農，孫 備，呂 凌

(1．安徽中醫藥大學，安徽合肥 230012;

2．安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽合肥 230051)

清熱解肌顆粒為中藥復方新藥，其處方出自明代《傷寒六書》，由柴胡、羌活、白芷、生姜等藥材組成，具有解肌清熱之功效，主治感冒［1－2]。處方中的柴胡、羌活、白芷、生姜4味藥材均含有揮發油，其中，《中國藥典》規定羌活藥材含揮發油不得少于1．4%(mL·g－1)，文獻報道［3－6]，揮發油為上述 4味藥材的主要有效成分，其藥效與本制劑的解熱、鎮痛、抗炎、抗菌等藥效基本相符，因此，本制劑工藝采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，考慮到揮發油易逸散和氧化變質，采用倍他環糊精包合工藝，以提高揮發油在制劑中的穩定性［7－9]。鑒于中藥復方制劑中揮發油含量測定和薄層鑒別研究的文獻報道較少，同時，為了更好地控制本制劑的質量和保證臨床療效，本文在通過氣—質聯用色譜儀 (GCMS)對揮發油提取物成分進行歸屬鑒定的基礎上，運用GC法采用單指標和總成分相結合的手段對制劑中的揮發油進行了含量測定，并進行薄層鑒別，從而達到有效控制其質量的目的。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 梅特勒電子天平(上海梅特勒－托利多有限公司)，氣相色譜質譜聯用儀(美國布魯克－道爾頓公司，MS．Workstation色譜工作站)，氣相色譜儀(Aglient7890A，FID檢測器，Aglient中文工作站)，硅膠G板(100 mm×100 mm，薄層層析用，青島海洋化工廠分廠)，揮發油測定器(天長市金橋分析儀器廠)，GZX－9140MBE數顯鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)。

1．2 試藥 柴胡、羌活、白芷、生姜等藥材購自安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司，并經安徽省食品藥品檢驗研究院陳師農研究員鑒定;α-蒎烯對照品，批號110897－200502、β-蒎烯對照品，批號110827－201202、桉油精對照品，批號110788－201105(均由中國食品藥品檢定研究院提供);清熱解肌顆粒自制(批號:20140706、20140707、20140708);水為去離子水，乙酸乙酯，石油醚(30～60℃)、甲苯、環己烷等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 揮發油的薄層色譜鑒別［3]取清熱解肌顆粒50 g，照揮發油測定法(中國藥典2010年版一部附錄X D)提取揮發油，取油層，加乙酸乙酯0．5 mL將揮發油溶解后，作為供試品溶液。按處方配比取柴胡、羌活、白芷和生姜對照藥材，同法制成對照藥材溶液。另取β-蒎烯對照品和桉油精對照品，分別加乙酸乙酯制成每1 mL含40 mg的溶液，作為對照品溶液。再按處方配比及制備工藝制成不含柴胡、羌活、白芷和生姜的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述5種溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚30～60℃—乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與藥材揮發油、對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾，結果見圖1。

圖1 制劑中揮發油的薄層色譜鑒別圖

2．2 GC-MS 對揮發油提取物成分的鑒定［10]

2．2．1 色譜條件 色譜柱:DB－5 ms毛細管色譜柱 (30 m ×0．25 mm ×0．25μm，美國 HP公司);載氣:氮氣;流速:1．0 mL·min－1;柱溫:40℃(1 min)至 50℃ (速率 5℃ ·min－1)，50℃ (1 min)至74℃(速率4 ℃·min－1)，74 ℃至220℃(速率5℃·min－1，至 220℃保持 1 min);進樣口溫度:250℃;質譜接口溫度:280℃;離子源溫度:280℃;電子轟擊電壓70 eV;全離子掃描，范圍33～350 m·z－1;進樣量:1．0μL;分流比:10∶1;運行時間:約 40 min。

2．2．2 供試品溶液的制備 取揮發油提取物約10 mg，置10 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2．2．3 揮發油提取物鑒定 精密吸取供試品溶液1．0μL注入氣相色譜儀中，記錄色譜圖。結果共測定出13個主要色譜峰，鑒定出12個化合物。結果見表1和圖2。

表1 揮發油化學成分分析

圖2 揮發油的GC－MS色譜圖

2．3 揮發油含量測定［11]

2．3．1 色譜條件 色譜柱:Agilent HP－5毛細管色譜柱 (30 m ×0．25 mm ×0．25μm);載氣:氮氣;流速1．0 mL·min－1;柱溫:40 ℃(1 min)至 220 ℃(速率5℃·min－1，至220℃保持1 min);檢測器:FID，溫度250℃;進樣口溫度:240℃;進樣量:1．0 μL;分流比:10 ∶1;運行時間:約38 min。

2．3．2 對照品溶液的制備 分別精密稱取 α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精對照品 60．5、49．8、46．5 mg，置10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。精密量取各對照品貯備液適量至同一量瓶中，得到混合對照品溶液，使其濃度分別為 15、2．5、5 mg·L－1的溶液。

2．3．3 供試品溶液的制備 取本品10 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加水10 mL振搖使顆粒分散溶化，再精密加入乙酸乙酯10 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min后放置室溫，再稱定重量，用乙酸乙酯補足減失的重量，取上清液(乙酸乙酯層)，即得。

2．3．4 陰性對照溶液的制備 按處方配比稱取除柴胡、羌活、白芷、生姜藥材以外的其他藥材，按制備工藝和供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2．3．5 專屬性試驗 取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液進樣，結果陰性對照溶液在對照品相應位置上無色譜峰，說明其他成分對測定無干擾。結果見圖3。

圖3 清熱解肌顆粒揮發油專屬性GC色譜圖

2．3．6 線性關系考察 將“2．3．2”項下對照品貯備液，用乙酸乙酯逐級稀釋成系列濃度的混合對照品溶液，分別進樣1．0μL，以峰面積A為縱坐標，以對照品濃度C(mg·L－1)為橫坐標，繪制標準曲線，結果α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精的回歸方程分別為Y=2．626 2X+0．720 3(r=1．000)、Y=2．526 0X+0．082 0(r=1．000)、Y=2．169 5X+0．045 4(r=1．000)，其線性范圍分別為 1．89 ～605．00，1．25 ～99．60，2．32 ～185．81 mg·L－1。

2．3．7 穩定性試驗 取供試品溶液分別于0、1．5、3、6、9、12、15、18 h(室溫，未避光)進樣，記錄供試品中 α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精的峰面積，結果 α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精的 RSD 分別為 1．01%、4．60%、1．92%，表明供試品溶液至少在18 h內穩定。

2．3．8 精密度試驗 按“2．3．3”項下供試品溶液處理方法平行處理6份樣品，測定三種成分的峰面積，計算含量。結果 α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精的RSD 分別為 1．32%、3．47%、1．41%(n=6)，表明該方法的精密度良好。

2．3．9 重復性試驗 取“2．3．2”項下配制的混合對照品溶液，按照“2．3．1”方法連續進樣5次，進行測定。結果α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精的RSD分別為0．87%、1．27%、0．50%(n=5)，表明該方法的重復性良好。

2．3．10 加樣回收率試驗 取已知含量樣品9份，每份10 g，精密稱定，分別加入 α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精對照品貯備液適量(按含量的80%，100%，120%加入)，按“2．3．3”項下供試品溶液制備方法制備，進樣1．0μL，計算各對照品的平均加樣回收率和RSD值，結果見表2。

2．3．11 定量限試驗 取“2．3．2”項下對照品溶液，逐級稀釋。按照“2．3．1”方法測定，使當信噪比S/N≥10時即可。結果 α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精的定量限分別為 1．89、1．25、2．32 ng。

2．3．12 樣品含量測定 取3批同一工藝生產的產品，按“2．3．3”項下供試品溶液制備方法制備，按照“2．3．1”方法測定樣品中 α-蒎烯，β-蒎烯，桉油精的含量，其余鑒定成分均以α-蒎烯作為對照計算含量。結果見表3。

表2 加樣回收率試驗結果(n=9)

表3 三批樣品含量測定結果/%

3 討論

本處方中柴胡、羌活、白芷為多基原藥材［3]，本研究結合藥材使用情況固定了藥材基原及產地，北柴胡(Bupleurum chinense DC．)，產地為陜西;羌活(Notopterygium incisum Ting ex H．T．Chang)，產地為四川;白芷(Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm)Benth．Et Hook．f．)，產地為安徽。基原及產地的固定，使得藥材的揮發油含量和所含化學成分相對穩定，有利于產品質量的控制。

薄層鑒別試驗中，采用三種展開劑［石油醚30～60℃—乙酸乙酯(9∶1);石油醚—甲苯—乙酸乙酯(7∶6∶1．5);環己烷—乙酸乙酯 (9．5∶0．5)]［3，12－13]，結果 α-蒎烯對照品均有干擾斑點，因此暫選用β-蒎烯，桉油精作為制劑中揮發油薄層色譜鑒別的對照品，α-蒎烯的薄層鑒別有待于進一步研究。

GC-MS對揮發油提取物的鑒定中，由于β-蒎烯含量較少，在化學成分分析表中未給出分析，但在揮發油含量測定試驗中，通過對照品確定其保留時間;由于只獲得α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精三種對照品，其他成分均未獲得標準物質，最終采用外標法計算樣品中上述三種成分的含量，測得結果這三種成分含量較低，因此以α－蒎烯作為對照計算揮發油總量(即 α-蒎烯，β-蒎烯，桉油精，樟烯，β-水芹烯，萜品烯，肉豆蔻醚，芹菜腦8種成分含量之和)。

樣品處理時通過考察單一因素變化對提取效果的影響，篩選出最佳提取方法。分別考察不加水、加水5 mL、加水10 mL以及樣品研磨處理四種方法，結果表明不加水處理造成顆粒不易溶解，但加水不足易產生乳化導致乙酸乙酯層不易分離，而顆粒經研磨處理會造成揮發油含量降低，因此，選擇了本實驗中樣品的處理方法。

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