輻射對人膠質瘤U251細胞COX-2和survivin表達的影響

儲進錦，張 帆，王 凡

(安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤放療科，安徽合肥 230022)

神經膠質瘤來源于神經上皮，是最常見的顱內原發腫瘤之一，約占顱內腫瘤的40% ～50%。膠質瘤是一種生物學特性非常復雜的惡性腫瘤，腫瘤生長迅速，向周圍組織浸潤能力強，手術難以全切，術后放療是重要的治療手段［1]。神經膠質瘤治療后復發以原發灶局部復發為主，而增加原發灶局部的放射劑量卻沒有提高原發灶局部控制率，患者多數在確診后1～2年內死亡，究其原因是人腦膠質瘤細胞存在放射抵抗性［2]。因此膠質瘤的治療效果差，預后不佳。環氧化酶是催化花生四烯酸向前列腺素轉化的關鍵限速酶，環氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)在正常組織中幾乎無表達，主要在腫瘤組織中表達，主要通過抑制細胞凋亡促進腫瘤的發生發展［3]。survivin是凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis proteins，IAP)的成員之一，是一類獨立于Bcl-2的內源性細胞凋亡抑制蛋白，具有抑制細胞凋亡和調節細胞有絲分裂的功能，在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用［4]。研究證實COX-2和survivin蛋白在膠質瘤組織中均高表達，尤其在Ⅲ～Ⅳ級高度惡性膠質瘤組織中表達明顯增多，促進膠質瘤的發生和發展［5-6]。本實驗通過體外培養人膠質瘤U251細胞，經X線照射后，觀察COX-2和survivin蛋白表達的變化，分析輻射對膠質瘤細胞COX-2和survivin蛋白表達的影響，了解輻射是否通過改變腫瘤細胞的抗凋亡能力來增加其放射抵抗性。

1 實驗材料和方法

1．1 研究對象和分組 人膠質瘤細胞系U251細胞購自中國科學院上海細胞庫，進行體外傳代培養，并隨機分為實驗組和對照組，實驗組為經過10 Gy劑量X線照射的細胞，對照組無特殊處理。

1．2 實驗試劑和器材 COX-2、survivin兔抗人多克隆抗體均購自英國Abcam公司;PV6000聚合物免疫組化檢測試劑盒、DAB濃縮型顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司;DMEM高糖培養基購自Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;CO2培養箱為HERA cell 150型;醫用電子加速器為美國瓦里安23EX型直線加速器;倒置顯微鏡為OLYMPUSCX41型。

1．3 細胞培養 細胞培養各操作均在無菌細胞培養室超凈臺內進行。人膠質瘤細胞系U251貼壁培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃、CO2體積分數5%的飽和濕度培養箱中培養，2～3 d換液一次，在倒置顯微鏡下觀察，待細胞生長面積達到培養瓶底約80% ～90%時，常規傳代:吸棄舊培養基，0．25%的胰蛋白酶消化，觀察到細胞間隙增大、形態變圓、細胞漂浮時加入含有血清的培養基終止胰酶消化，收集細胞懸液，離心后制成單細胞懸液，并置于培養箱中繼續培養。重復以上操作，同時觀察細胞生長情況，細胞貼壁狀況良好，排列較為緊密，培養基清亮，無明顯雜質及沉淀，說明細胞已處于對數生長期，可用于實驗。

1．4 照射方式 取處于對數生長期的實驗組及對照組U251細胞，0．25%胰酶消化后制成單細胞懸液，分別接種于六孔板中，培養至細胞鋪滿板底70% ～80%后，實驗組細胞釆用直線加速器6MVX線垂直照射，照射方法:室溫下進行源皮距照射，劑量率為200 cGy·min-1，照射野為10 cm×10 cm，源皮距(射線至板頂)為100 cm，劑量為10 Gy，接受照射后再立即放回培養箱中。對照組細胞同步進行傳代培養，但不予X線照射。

1．5 細胞爬片制作及免疫組化 將實驗組及對照組細胞繼續培養48 h，分別取對數生長期細胞，將0．25%胰蛋白酶消化后的細胞懸液分別接種于預先置有細胞爬片的六孔板中培養，每組細胞各制作10張細胞爬片。從六孔板中取出爬片，pH7．2的PBS液沖洗3次，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，0．5%TxitonX-100室溫下處理 20 min，后采用PV6000免疫組化法染色:3%過氧化氫去離子水室溫下處理10 min，PBS液沖洗3次，每組其中5張滴加 COX-2一抗(稀釋濃度為1∶800)，另外5張滴加survivin一抗(稀釋濃度為1∶1 500)，置于4℃冰箱孵育過夜，PBS液沖洗后滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體(二抗)，37℃溫箱中孵育20 min，DAB試劑顯色5 min，待陽性染色為黃色或棕黃色后，蘇木素復染細胞核1 min，沖洗，烤干，封片，觀察。每組細胞爬片按以上操作重復3次實驗。

1．6 結果判定 細胞免疫組化結果利用生物圖像分析軟件，每張細胞爬片隨機選取5個高倍(×400)視野，分別測定平均光密度值，用平均光密度值來表示細胞中COX-2和survivin蛋白的相對含量。

1．7 統計分析 運用SPSS19．0統計學軟件進行數據處理，數據采用均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗進行統計學分析，P＜0．05認為差異有統計學意義。

2 實驗結果

COX-2和survivin蛋白在未處理的對照組人膠質瘤U251細胞的細胞質和細胞核中均有表達，呈黃色或者棕黃色。經過10 Gy劑量X射線照射48 h后，檢測到COX-2和survivin蛋白在細胞內的染色變深，平均光密度值增加，說明兩者的表達量較未照射組均明顯增加(P ＜0．05)，見表1，圖1，圖 2。

表1 生物圖像分析系統定量分析輻射對人膠質瘤U251細胞COX-2和survivin蛋白表達的影響

圖1 免疫組化法檢測輻射對COX-2蛋白表達的影響(A:對照組，B:實驗組)(×400)

圖2 免疫組化法檢測輻射對survivin蛋白表達的影響(C:對照組，D:實驗組)(×400)

3 討論

細胞凋亡是一種由基因控制的細胞自主性死亡方式，在凋亡刺激因子作用下通過啟動細胞內死亡機制和信號轉導途徑，最終發生細胞程序性死亡的過程，它是一種細胞生長的負性調控機制。細胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達以及調控，多種基因相互作用共同調節細胞的增殖和凋亡。近年來研究表明，腫瘤不僅是一種增殖失控的疾病，也是細胞凋亡異常的疾病。正常情況下，細胞應處于增殖與凋亡的動態平衡狀態，凋亡調控基因的表達異常直接導致了細胞凋亡異常，這使得細胞分裂周期失調的細胞逃脫正常的監控機制而異常增殖，導致腫瘤的發生、發展。

環氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸向前列腺素轉化的關鍵的限速酶，其存在兩種亞型:結構型COX-1和誘導型COX-2。COX-1是表達于大部分組織的結構酶，定位于內質網，呈穩定持續表達，COX-2為一種誘導酶，定位于細胞質和核膜。一般認為COX-2在正常生理狀態下多數組織不表達，當受到包括生長因子、細胞因子、炎性介質、各種促癌因素等刺激因素作用時，其表達量迅速上調［7]。大量研究證實COX-2可從多個環節參與腫瘤的形成，具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖分化、促進腫瘤血管生成、干擾細胞正常免疫及促進腫瘤轉移和侵襲的生物學作用，在乳腺癌、食管癌、胃腸道惡性腫瘤等多種癌組織中高表達［8]。COX-2的主要產物前列腺素(PGE)可促進細胞的增殖、侵襲、血管生成，抑制細胞凋亡，與腫瘤的發展密切相關，在正常組織中無表達，而在腫瘤中高表達［9]。survivin蛋白是凋亡抑制蛋白IAP家族的成員之一，生物學功能主要有抑制細胞凋亡、調控細胞周期、調節有絲分裂、促進細胞增殖，在分化成熟的組織中不表達，特異性地高表達于多種惡性腫瘤中，如肺癌、胃癌，包括膠質瘤，因此被認為是在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用的一個關鍵分子［10]。survivin蛋白是染色體分裂和細胞質分裂中關鍵的調節因子，survivin在G2/M期高表達，可通過相應的調控機制使細胞逃避G2/M期的校正，不能有效對腫瘤細胞進行監控，從而誘導其異常分裂，抑制了腫瘤細胞的凋亡［11]。survivin蛋白還可通過抑制caspase信號通路來阻斷細胞的凋亡程序，caspase級聯活化是細胞凋亡發生的核心機制，survivin可作用于終末效應因子 caspase-3和caspase-7，通過抑制其表達，干擾凋亡信號的傳導，從而進一步阻斷細胞的凋亡程序［12]。

放射治療是腫瘤治療的重要手段之一，電離輻射的生物效應主要由對DNA的損傷所致，關鍵靶點是DNA。輻射可誘導細胞基因組的不穩定性，導致基因表達的變化，發生遺傳異常、細胞形態異常、功能異常，正是這些基因表達的異常，從而引起細胞生物特性改變。Pervan M［13]的實驗顯示輻射可誘發多數腫瘤細胞凋亡，但有的腫瘤細胞即使給予較高輻射劑量也不會發生凋亡。Anai S［14]報道當腫瘤細胞暴露于小劑量的放射線時，細胞會上調COX-2蛋白的表達，這可能是腫瘤細胞產生放射損傷逃逸現象的途徑之一。Steinauer［15]研究顯示:放射治療是COX-2蛋白表達的一種刺激因素，COX-2的表達隨著照射劑量的增加而顯著增加，同時COX-2的主要產物前列腺素2(PGE2)的水平在放射治療后也明顯升高，呈劑量依賴性，且前列腺素及其類似物已被證實是輻射損傷的細胞保護劑。survivin可增加腫瘤細胞的放射抗拒作用，survivin蛋白的高表達與膠質瘤的放射抵抗性有關，下調survivin的表達或是抑制其功能，可以提高腫瘤細胞對放射治療的敏感性［16]。Jin X 等［17]發現，下調腫瘤細胞內survivin蛋白的表達后，輻射誘導的細胞凋亡大大增加。Khan等［18]發現，下調survivin蛋白水平或者進行基因消除后，頭頸部腫瘤細胞的放射敏感性明顯增高。本實驗的研究結果顯示，在10Gy劑量的照射條件下，輻射可誘導人膠質瘤U251細胞COX-2和survivin蛋白表達的明顯增加。我們可以推測出，在膠質瘤放射治療過程中，一部分腫瘤細胞發生了凋亡，存活下來的細胞通過上調COX-2和survivin蛋白的表達，產生一系列的抗凋亡效應，抑制了這部分細胞的凋亡，逃避了放射線的損傷，對放射治療的敏感性大大下降，因此不能達到預期的療效，為日后復發留下隱患。

在當今惡性腫瘤的治療領域里，只進行傳統的手術、放療和化療并不能達到顯著的療效，輔助治療的地位日益突出，而靶向治療是基于對特定靶點結構和功能的認識，通過干擾特異性分子而阻斷腫瘤的生長和擴散，其在未來的腫瘤治療中將發揮巨大的作用。為進一步提高放療療效，不增加周圍正常組織毒副反應，在放療過程中需要利用各種輔助手段來降低某些腫瘤對輻射的抵抗能力，提高其放射敏感性，放射增敏劑是重要的輔助治療方法之一［19]。COX-2和survivin是當下比較熱門的基因靶點，怎樣消除膠質瘤的放射抵抗性，如何增強膠質瘤的放射敏感性也是當前膠質瘤治療領域的研究熱點之一。已有研究將COX-2和survivin作為增強膠質瘤放射敏感性的靶點，旨在通過提高腫瘤細胞對放射線的敏感性，來實現在不增加放療劑量的基礎上，提高放療的療效，減少復發，延長患者生存時間。聶斌等［20]研究COX-2抑制劑塞來昔布對腦膠質瘤SHG-44細胞放射增敏的作用，結果顯示塞來昔布(30μmol·L-1)可增加SHG-44細胞的放射敏感性，與誘導腫瘤細胞自噬和G2/M期阻滯有關。聶亮琴等［21]研究表明塞來昔布可通過參與調節細胞周期和減少DNA損傷修復來增強腦膠質瘤細胞u373的放射增敏性，其增敏比為1．21，明顯高于正常腦組織細胞，這證明COX-2抑制劑塞來昔布可作為提高膠質瘤放療療效的手段之一。張瞳光等［22]通過克隆形成試驗和皮下移植瘤試驗發現survivin基因過度表達和惡性膠質瘤的放療抵抗性密切相關，抑制survivin基因能夠顯著增強膠質瘤的放射敏感性。Reichert［23]通過siRNA下調惡性膠質瘤LN229細胞survivin的表達，結果顯示細胞凋亡明顯增加，DNA損傷修復作用減弱，克隆形成率下降，放射敏感性增強，說明下調survivin可減少輻射誘導的DNA損傷的修復。COX-2抑制劑NS398作用于肝癌細胞中可降低survivin的表達，相關性分析顯示NS-398作用后COX-2與survivin蛋白表達呈顯著正相關［24]，提示COX-2和survivin之間的確可能存在某種聯系，但其中的具體機制仍不清楚，因此COX-2和survivin在促進腫瘤作用中的內在聯系有待于深入研究，以進一步了解膠質瘤產生放療抵抗的分子機制。

綜上所述，本研究結果表明輻射可誘導膠質瘤細胞COX-2和survivin蛋白的表達增多，這可能是膠質瘤存在放射抵抗的機制之一。設想通過各種手段下調COX-2和survivin蛋白的表達可增加細胞的凋亡，提高膠質瘤對輻射的敏感性，為臨床尋找更加有效的治療方式提供了新的方向。本研究仍存在一些不足，例如沒有進行細胞放射增敏性的研究，沒有將照射劑量進行更為細致的分組，且后期還需要進一步調控COX-2的表達來觀察其對膠質瘤放射效應的影響以及survivin的變化，探討COX-2及survivin之間的關系，以進一步了解神經膠質瘤產生放療抵抗的分子機制，為臨床優化膠質瘤的治療提供新的理論和實驗依據。

［1] Lima FR，Kahn SA，Soletti RC，et al．Glioblastoma:Therapeutic challenges，what lies ahead［J]．Biochim Biophys Acta，2012，1826(2):338-349．

［2] Sheehan JP，Shaffrey ME，Gupta B，et al．Improving the radiosensitivity of radioresistant and hypoxic glioblastoma［J]．Future Oncol，2010，6(10):1591-1601．

［3] Hoellen ，Kelling K，Dittmer C，et al．Impact of cyclooxygenase-2 in breast cancer［J]．Anticancer Res，2011，31(12):4359-4367．

［4] Kanwar JR，Kamalapuram SK，Kanwar RK．Targeting survivin in cancer:patent review［J]．Expert Opin Ther Pat，2010，20(12):1723-1737．

［5] El-Sayed M，Taha MM．Immunohistochemical expression of cycloxygenase-2 in astrocytoma:correlation with angiogenesis，tumor progression and survival［J]．Turk Neurosurg，2011，21(1):27-35．

［6] 倪 恒，竇長武．生存素survivin與腦膠質瘤的研究進展［J]．中外醫學雜志，2014，12(14):150-153．

［7] 劉永慶，童斯浩，鮑揚漪，等．塞來昔布對肝癌HepG2 HepG3細胞的免疫增敏作用［J]．安徽醫藥，2014，18(7):1336-1340．

［8] Ke HL，Tu HP，Lin HH，et al．Cyclooxygenase-2(COX-2)upregulation is a prognostic marker for poor clinical outcome of upper tract urothelial cancer［J]．Anticancer Res，2012，32(9):4111-4116．

［9] Kim YM，Shin YK，Jun HJ，et al．Systematic analyses of genes associated with radiosensitizing effect by celecoxib，a specific cyclooxygenase-2 inhibitor［J]．J Radiat Res，2011，52(6):752-765．

［10] Altieri DC．Survivin and IAP proteins in cell-death mechanisms［J]．Biochem J，2010，430(2):199-205．

［11] Mobahat M，Narendran A，Riabowol K．Survivin as a preferential target for cancer therapy［J]．Int J Mol Sci，2014，15(2):2494-2516．

［12]張賀春，竇長武．凋亡蛋白抑制因子Survivin在腦膠質瘤中的作用研究進展［J]．內蒙古醫科大學學報，2014，36(3):283-287．

［13] Pervan M，Pajonk F，Sun JR，et al．Molecular pathways that modify tumor radiation response［J]．Am JClin Oncol，2001，24(5):481-485．

［14] Anai S，Tanaka M，Shiverick KT，et al．Increased expression of cyclooxygenase-2 correlates with resistance to radiation in human prostate adenocarcinoma cells［J]．J Urol，2007，177(5):1913-1917．

［15] Steinauer KK，Gibbs I，Ning S，et al．Radiation induces upregulation of cyclooxygenase-2(COX-2)protein in PC-3 cells［J]．Int J Radiat Oncol Biol Phys，2000，48(2):325-328．

［16] Rǒdel F，Reichert S，Sprenger T，et al．The role of survivin for radiation oncology:moving beyond apoptosis inhibition［J]．Curr Med Chem，2011，18(2):191-199．

［17] Jin X，Li Q，Wu Q，et al．Radiosensitization by inhibiting survivin in human hepatoma HepG2 cells to high-LET radiation［J]．J Radiat Res，2011，52(3):335-341．

［18] Khan Z，Khan N，Tiwari RP，et al．Down-regulation of survivin by oxaliplatin diminishes radioresistance of head and neck squamous carcinoma cells［J]．Radiother Oncol，2010，96(2):267-273．

［19]冉晨曦，何人可，湯小玲，等．腫瘤放射治療中輻射增敏劑的應用進展［J]．山東醫藥，2015，55(3):86-88．

［20]聶 斌，周菊英，吳 瓊，等．自噬在塞來昔布對腦膠質瘤SHG-44細胞放射增敏效應中的作用［J]．蘇州大學學報(醫學版)，2012，32(1):18-23．

［21]聶亮琴，周菊英，王利利，等．塞來昔布對正常腦膠質細胞和腦膠質瘤細胞放射增敏效應的比較及其機制［J]．中華放射醫學與防護雜志，2014，34(5):342-345．

［22]張瞳光，杜利力，劉顯明，等．siRNA沉默survivin基因表達對惡性膠質瘤細胞放射敏感性的影響［J]．中國藥業，2010，19(9):15-17．

［23] Reichert S，R?del C，Mirsch J，et al．Survivin inhibition and DNA double-strand break repair:A molecular mechanism to overcome radioresistance in glioblastoma［J]．Radiother Oncol，2011，101(1):51-58．

［24] 付衛爭，孫國平，范璐璐，等．環氧合酶-2選擇性抑制劑NS398誘導人肝癌細胞BEL-7402凋亡及其機制探討［J]．腫瘤，2010，30(1):11-14．