基于活細(xì)胞顯微技術(shù)的登革病毒膜融合實(shí)驗(yàn)方法的建立及初步應(yīng)用

李 潔，徐元宏

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽合肥 230022)

登革病毒(DENV)是一種小型包膜病毒，主要通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用以及隨著病毒包膜與宿主細(xì)胞內(nèi)涵體膜的融合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制［1]。作為包膜病毒進(jìn)入細(xì)胞并將基因組釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必需的步驟，病毒—細(xì)胞膜融合過(guò)程是通過(guò)一種或者多種病毒表面蛋白即融合蛋白發(fā)生構(gòu)象的變化得以觸發(fā)［2]。DENV與宿主細(xì)胞膜的融合是通過(guò)在內(nèi)涵體酸性pH環(huán)境誘導(dǎo)下包膜E蛋白的結(jié)構(gòu)學(xué)重排來(lái)實(shí)現(xiàn)的［3]。人們已經(jīng)證實(shí)抑制病毒與宿主細(xì)胞膜融合是一種抗病毒中和作用機(jī)制［4]，因此深入分析抗體在蟲(chóng)媒病毒與宿主細(xì)胞膜融合的作用，對(duì)于理解抗體的中和作用機(jī)制至關(guān)重要。

目前，人們對(duì)抗體是否具備膜融合抑制能力的研究主要采用兩種實(shí)驗(yàn)方法:一種是傳統(tǒng)的膜融合抑制實(shí)驗(yàn)，借助顯微鏡觀察抗體是否影響病毒—宿主細(xì)胞膜融合后合胞體的形成［5];另一種是脂質(zhì)體浮選實(shí)驗(yàn)，用脂質(zhì)體模擬病毒敏感性細(xì)胞的細(xì)胞膜，最后通過(guò)脂質(zhì)體浮選對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析［6]。前者只能通過(guò)肉眼觀察合胞體形成判斷結(jié)果，要求操作者具備豐富的經(jīng)驗(yàn)，存在一定的主觀性;后者未采用活細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，操作不便。以上兩種實(shí)驗(yàn)方法均不能對(duì)抗體的膜融合抑制能力進(jìn)行定量分析。因此，我們借助Incell Analyzer 2000高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)建立一種基于活細(xì)胞顯微技術(shù)的膜融合實(shí)驗(yàn)新方法，對(duì)登革病毒抗體在病毒—細(xì)胞膜融合過(guò)程中的作用進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量的分析計(jì)算，此方法同樣適用其他蟲(chóng)媒病毒，為深入理解蟲(chóng)媒病毒中和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試劑 RPMI－1640，胎牛血清 FCS，購(gòu)于Invitrogen公司;96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板及購(gòu)自美國(guó)Corning Life Sciences公司產(chǎn)品;抗體9F12、4G2為澳大利亞昆士蘭大學(xué)傳染病研究中心(Australian Infectious Diseases Research Centre)惠贈(zèng)，其中4G2單抗是一株針對(duì)DENV融合肽(Fusion loop)的商品化交叉抗體，能夠阻斷病毒—細(xì)胞膜融合［7]，將此抗體作為膜融合實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。單抗9F12是一株針對(duì)DENV EDⅢ區(qū)的交叉中和抗體，傳統(tǒng)的膜融合實(shí)驗(yàn)顯示此單抗具備抑制膜融合能力［5]，我們將此單抗用于膜融合實(shí)驗(yàn)新方法的初步驗(yàn)證。

1．1．2 病毒和細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)中病毒采用 DENV-2，New Guiea-C來(lái)自于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心;C6/36蚊子細(xì)胞購(gòu)自ATCC。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) C6/36細(xì)胞用含10%FBS、20 mol·L－1HEPES、谷酰胺的 RPMI－1640 培養(yǎng)基于28℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增。

1．2．2 確定膜融合實(shí)驗(yàn)介導(dǎo)病毒—細(xì)胞膜融合的最佳pH值 (1)用RPMI 1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基 (含有10%FBS，20 mmol·L－1HEPES 及谷酰胺)將 C6/36細(xì)胞(8×105個(gè))接種至96孔微量培養(yǎng)板，置于28°C含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱過(guò)夜;(2)吸棄生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，將DENV2(MOI值為2)加入96孔板，28°C感染細(xì)胞2 h后棄去，加入RPMI 1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(200μL);(3)孵育48 h以后，用預(yù)先調(diào)整好不同pH值的25 mmol·L－1MES(用HCl調(diào)整 pH 至5．0、5．5、6．0、6．5、7．0、7．5)的無(wú)血清RPMI－1640將4G2及陰性對(duì)照單抗進(jìn)行稀釋后加入細(xì)胞中(100μL)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3個(gè)復(fù)孔;(4)將細(xì)胞置于40°C孵育，同時(shí)借助 Incell Analyzer 2000高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞的狀態(tài)變化。

1．2．3 確定膜融合實(shí)驗(yàn)的最佳觀察時(shí)間 pH值降低誘導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞發(fā)生膜融合以后，需要選取最佳觀察時(shí)間點(diǎn)，如過(guò)早則融合尚未完全發(fā)生，如過(guò)遲則正常細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，影響結(jié)果分析。在確定實(shí)驗(yàn)的最佳pH值后，進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)的最佳觀察時(shí)間，實(shí)驗(yàn)方法同“1．2．2”，在加入低 pH 值的抗體后，將細(xì)胞置于40°C預(yù)熱的Incell Analyzer 2000儀器中，設(shè)置為每隔10 min拍攝細(xì)胞狀態(tài)，獲取不同時(shí)間點(diǎn)的病毒—細(xì)胞膜融合圖片數(shù)據(jù)，通過(guò)軟件進(jìn)行分析比較，得出最佳觀察時(shí)間點(diǎn)。

1．2．4 膜融合實(shí)驗(yàn)新方法測(cè)定中和抗體9F12的膜融合抑制能力 確定基于活細(xì)胞顯微技術(shù)膜融合實(shí)驗(yàn)的最佳實(shí)驗(yàn)條件后，將單抗9F12、4G2及無(wú)關(guān)陰性對(duì)照單抗進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行膜融合實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)抗體抑制病毒—細(xì)胞膜融合的能力，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

1．3 儀器 Incell Analyzer 2000高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析儀，美國(guó)GE公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司。

1．4 數(shù)據(jù)分析 用IN Cell investigator數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)膜融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析，對(duì)拍攝圖片上的活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后借助GraphPadPrism 5．0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。最佳pH值確定實(shí)驗(yàn)中，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13．0的單因素方差分析One Way ANOVA，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的兩兩比較采用SNK－Q檢驗(yàn)的方法。

2 結(jié)果

2．1 膜融合實(shí)驗(yàn)中介導(dǎo)病毒—細(xì)胞膜融合的最佳p H值 蟲(chóng)媒病毒與宿主細(xì)胞膜的融合是通過(guò)在內(nèi)涵體酸性pH環(huán)境誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)的，其中pH值的下降起著關(guān)鍵性的作用。因此，最佳pH值的確定對(duì)于建立基于活細(xì)胞顯微技術(shù)的膜融合實(shí)驗(yàn)新方法至關(guān)重要。pH值過(guò)高則膜融合的發(fā)生不夠充分，如過(guò)低則膜融合發(fā)生過(guò)快，不利于觀察及獲取數(shù)據(jù)。我們通過(guò)對(duì) 5．0、5．5、6．0、6．5、7．0 這 5 個(gè)不同 pH值條件下，各實(shí)驗(yàn)組的膜融合現(xiàn)象進(jìn)行觀察，并定量分析，最終選取膜融合實(shí)驗(yàn)新方法最合適的pH值條件。如圖1A所示，除pH 7．0組，其他pH值條件均誘導(dǎo)了不同程度的病毒—細(xì)胞膜融合發(fā)生。pH 值5．0、5．5、6．5 條件下，陽(yáng)性對(duì)照及無(wú)關(guān)單抗對(duì)照組均出現(xiàn)了膜融合現(xiàn)象，活細(xì)胞數(shù)量與未感染病毒的正常細(xì)胞數(shù)量相比均顯著降低(P＜0．05)，然而陽(yáng)性4G2對(duì)照組與無(wú)關(guān)單抗組之間卻未顯示出顯著差異(P＞0．05)，說(shuō)明這些pH值條件下不能觀察到3個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的膜融合有明顯的差異。只有在pH值為6．0時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)關(guān)單抗對(duì)照組及正常細(xì)胞組之間比較均有顯著的差異(P＜0．05)(圖1B)，說(shuō)明在此條件下能夠觀察到陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)關(guān)單抗組及正常細(xì)胞在膜融合實(shí)驗(yàn)中存在顯著的膜融合差異，并最終進(jìn)行分析計(jì)算。因此，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中均采用pH 6．0作為膜融合實(shí)驗(yàn)新方法的最佳pH條件。

圖1 膜融合實(shí)驗(yàn)新方法的最pH值測(cè)定

圖2 膜融合實(shí)驗(yàn)新方法的最佳時(shí)間點(diǎn)測(cè)定

2．2 膜融合實(shí)驗(yàn)新方法最佳觀察時(shí)間點(diǎn)測(cè)定 在確定了膜融合實(shí)驗(yàn)新方法的最佳pH值以后，需要選定最為合適的時(shí)間點(diǎn)觀察各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的病毒—細(xì)胞膜融合，并拍攝活細(xì)胞狀態(tài)圖片，最后通過(guò)軟件對(duì)活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖2所示，在pH值降低介導(dǎo)膜融合開(kāi)始后的20 min內(nèi)，未見(jiàn)明顯的病毒—細(xì)胞膜融合所致的合胞體形成;第30分鐘開(kāi)始，無(wú)關(guān)單抗組出現(xiàn)明顯的膜融合，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)膜融合程度逐漸加劇，活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少;在100 min的時(shí)候，結(jié)果顯示病毒—細(xì)胞膜融合已經(jīng)達(dá)到最大且一直持續(xù)至隨后的所有時(shí)間點(diǎn)。陽(yáng)性對(duì)照4G2顯示出了較強(qiáng)的膜融合抑制能力，而正常細(xì)胞組未見(jiàn)明顯的膜融合。因此我們認(rèn)為在pH值降低后100 min是觀察并分析膜融合發(fā)生的最佳時(shí)間點(diǎn)，在此時(shí)間點(diǎn)上既能觀察到充分的膜融合現(xiàn)象，正常細(xì)胞形態(tài)亦沒(méi)有受到影響。

2．3 單抗9F12的膜融合抑制活性測(cè)定 我們通過(guò)新建立的膜融合實(shí)驗(yàn)體系對(duì)交叉中和抗體9F12的膜融合抑制活性進(jìn)行測(cè)定，將4G2和一株無(wú)關(guān)單抗分別作為陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2株單抗確實(shí)如前期研究所示能夠阻斷病毒—細(xì)胞宿主膜融合，且呈現(xiàn)出劑量依賴模式(見(jiàn)圖3A)，9F12和4G2 半數(shù)抑制濃度 IC50分別為 0．02、0．03 g·L－1。在高濃度作用下(1．0 g·L－1)，單抗9F12組的細(xì)胞融合率為12．9%，高于陽(yáng)性對(duì)照4G2組的7．6%。(見(jiàn)圖3B)。另外，無(wú)關(guān)單抗組及病毒對(duì)照組的細(xì)胞膜融合率均達(dá)到了90%以上，而正常細(xì)胞組未見(jiàn)到膜融合。

3 討論

登革病毒(DENV)廣泛流行于熱帶和亞熱帶的許多國(guó)家和地區(qū)，是亞洲和拉丁美洲一些國(guó)家兒童嚴(yán)重患病和死亡的主要原因之一［8]。DENV屬于黃病毒科的黃病毒屬，該種屬還包含了其他重要的人病原體如日本腦炎(Japanese encephalitis，JE)西尼羅(west nile，WN)黃熱病(yellow fever，YF)及蜱傳腦炎(tick borne encephalitis，TBE)等病毒［9]。作為一種小型包膜蟲(chóng)媒病毒，DENV通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用以及隨著病毒包膜與宿主細(xì)胞內(nèi)涵體膜的融合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制［10]。不同包膜病毒激活融合蛋白構(gòu)象變化的因素并不相同，主要分為三種［1]:(1)低pH環(huán)境(蟲(chóng)媒病毒、流感病毒);(2)與受體相互作用(副粘液病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒);(3)pH降低與受體作用同時(shí)存在(α逆轉(zhuǎn)錄病毒)。目前，世界上既無(wú)安全有效的登革病毒疫苗，亦無(wú)特異性的治療藥物［11－12]。大量的研究集中于抗病毒中和抗體的作用機(jī)制分析，中和抗體被證實(shí)能夠通過(guò)抑制病毒與宿主細(xì)胞膜融合而中和病毒感染。本研究建立了一種有別于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法的膜融合實(shí)驗(yàn)新方法對(duì)抗體的膜融合抑制活性進(jìn)行測(cè)定。此方法基于活細(xì)胞顯微技術(shù)，借助Incell Analyzer 2000高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，既能實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞膜融合的發(fā)生、發(fā)展，又能通過(guò)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。經(jīng)過(guò)對(duì)膜融合實(shí)驗(yàn)新方法進(jìn)行優(yōu)化后，我們最終確立了實(shí)驗(yàn)的最佳酸性環(huán)境及最佳數(shù)據(jù)讀取時(shí)間，分別為pH值6．0及環(huán)境酸性化后的100 min。

圖3 中和抗體9F12的膜融合抑制活性測(cè)定

我們將優(yōu)化的膜融合實(shí)驗(yàn)新方法初步應(yīng)用于2株中和抗體4G2、9F12，前期研究顯示二者具備抑制膜融合的能力。我們的新方法進(jìn)一步證實(shí)了4G2和9F12均具備抑制病毒包膜與宿主細(xì)胞內(nèi)涵體膜融合的能力，且呈現(xiàn)劑量依賴模式，最終計(jì)算出精確的IC50。這一結(jié)果說(shuō)明我們的基于活細(xì)胞顯微技術(shù)的膜融合實(shí)驗(yàn)方法不僅能夠非常清晰地觀察DENV中和抗體是否具備膜融合抑制能力，還能計(jì)算出相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度，獲得精確的定量結(jié)果。

總之，本研究建立了一種基于活細(xì)胞顯微技術(shù)的膜融合抑制實(shí)驗(yàn)新方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化后證實(shí)此方法可應(yīng)用于登革病毒中和抗體的膜融合能力測(cè)定，有助于深入了解抗體的中和作用機(jī)制。同時(shí)，該體系同樣適用于其他蟲(chóng)媒病毒，為登革病毒及其他蟲(chóng)媒病毒的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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