前列腺癌中Sp1通過PKM2途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖代謝

劉大闖，梁清，陶陶，黃燁清，許斌，陳恕求，張治國，董洋，韓從輝，陳明

(1.東南大學(xué)附屬徐州市中心醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 徐州 221009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 南京 210009；3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 外科中心實驗室，江蘇 南京 210009)

·論 著·

前列腺癌中Sp1通過PKM2途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖代謝

劉大闖1，2，3，梁清1，陶陶2，3，黃燁清2，3，許斌2，3，陳恕求2，3，張治國1，董洋1，韓從輝1，陳明2，3

(1.東南大學(xué)附屬徐州市中心醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 徐州 221009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 南京 210009；3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 外科中心實驗室，江蘇 南京 210009)

目的:確定前列腺癌中Sp1通過PKM2途徑對前列腺癌細(xì)胞的增殖和代謝的作用。方法:前列腺癌細(xì)胞株DU145與PC3體外轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA與陰性對照無意義核苷酸序列(NC組)，采用葡萄糖檢測試劑盒與乳酸檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后有氧糖酵解變化；CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖；qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后PKM2表達(dá)；Western Blotting檢測轉(zhuǎn)染后Sp1與PKM2表達(dá)。結(jié)果：DU145與PC3轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后與NC組比較，剩余葡萄糖顯著偏高，乳酸產(chǎn)生顯著下降；CCK8實驗表明抑制Sp1后能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖能力；qRT-PCR實驗顯示抑制Sp1后明顯抑制PKM2的表達(dá)；Western Blotting顯示轉(zhuǎn)染的Sp1 siRNA對Sp1具有較高的沉默效率，且PKM2的表達(dá)也降低。結(jié)論：Sp1在前列腺癌細(xì)胞株DU145與PC3中可通過直接作用于PKM2促進(jìn)細(xì)胞代謝。

前列腺癌；特殊蛋白1；細(xì)胞增殖；丙酮酸激酶同工酶M2型；有氧糖酵解

轉(zhuǎn)錄因子特殊蛋白1(specificity protein 1， Sp1)是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，通過Cys2His2鋅指DNA結(jié)合域與GC盒(GGCGGG)和GT盒(CACCC)結(jié)合，可調(diào)控下游基因啟動子中富含GC序列的細(xì)胞和病毒基因的轉(zhuǎn)錄過程[1]。丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase，PKM2)是PK的4種同工酶之一,又稱胚胎型PK，源于PKM基因獨特的選擇性剪切。PKM基因定位于15q22，由12個外顯子和11個內(nèi)含子組成，M1型與M2型的差異在于轉(zhuǎn)錄后外顯子的選擇性剪接加工，M2型同工酶保留10號外顯子，M1型同工酶保留9號外顯子，兩種同工酶間有21個氨基酸的差異[2]。PKM2被認(rèn)為是原型，在個體發(fā)育分化時骨骼肌、肝和紅細(xì)胞中逐漸分別被M1型、L型和R型同工酶取代[3]。但在腫瘤發(fā)生過程中，PKM2重新表達(dá)以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并且多以具有活性的二聚體形式存在。腫瘤細(xì)胞即便是在氧供應(yīng)充足情況下仍產(chǎn)生大量乳酸，這種在有氧條件下仍將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的現(xiàn)象稱為有氧糖酵解，又稱Warburg效應(yīng)[4]。糖酵解的上調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的酸毒性對正常細(xì)胞有明顯抑制作用，而對抗酸性較強的腫瘤細(xì)胞來說能助其增殖和浸潤。PKM2在包括前列腺癌在內(nèi)的幾乎所有的腫瘤中表達(dá)均增加。有研究表明，Sp1可能促進(jìn)PKM2的表達(dá)[5]。關(guān)于腫瘤代謝的研究日益受到重視，本研究旨在確定前列腺癌中Sp1通過PKM2途徑對前列腺癌的增殖和代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 人前列腺癌細(xì)胞株DU145與PC3細(xì)胞(來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.2主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶(Gibco 公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素-鏈霉素雙抗生素(上海捷瑞生物公司)；Sp1 小干擾RNA(Sp1 siRNA):正義鏈5′-GGUCAGUUGGCAGACUCUATT-3′，反義鏈5′-UAGAGUCUGCCAACUGACCTT-3′,PKM2的上游引物序列:5′-CGCCTGGACATTGATTCA-3′，下游序列:5′-GTTCAGACGAGCCACATT-3′(均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)；Opti-MEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Trizol(Invitrogen公司)；SYBR Green染料法逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR試劑盒(PrimeScriptOne-Step RT-PCR Kit， Takara公司)；CCK-8 Kit、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA(強)蛋白裂解液(中國碧云天生物技術(shù)研究所)；葡萄糖分析試劑盒、乳酸分析試劑盒(BioVision公司)；兔抗人SP1一抗(Cell Signaling Technology公司)；兔抗人PKM2一抗(Santa-Cruz Biotechnology公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；聚偏氟乙烯PVDF膜(Millipore公司)；溴酚藍(lán)，吐溫-20(Sigma公司)；Tris-base，十二烷基硫酸鈉(SDS)，丙烯酰胺(BioSharp公司)；過硫酸銨(Promega公司)；預(yù)染蛋白分子量Marker(Fermentas公司)；Cocktail蛋白酶抑制劑混合物(Merck公司)；四甲基二乙胺(TEMED)(Amresco公司)；ECL發(fā)光檢測試劑盒(Millipore公司)；甲醇(廣東汕頭市西隴化工廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 以含10%胎牛血清、1%青-鏈雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、95%飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，每周傳代2～3次。選擇對數(shù)生長期DU145與PC3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 d以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞， 800 r·min-1離心3 min，以無抗生素RPMI 1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液(6×105孔-1)接種于的6孔培養(yǎng)板中(每孔含2 ml不含抗生素的完全培養(yǎng)基)，細(xì)胞密度約為5×104ml-1，24 h內(nèi)在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞融合約60%左右可以用于轉(zhuǎn)染，將4 μg Sp1 siRNA和4 μg 陰性對照無意義核苷酸序列(NC)分別加入250 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基中，吹勻；將5 μl Lipofectamine 2000加入另一250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基，吹勻；5 min后，將兩管液體混勻，室溫放置30 min；將上述500 μl 混合物加入6孔板中，搖勻；將6孔板置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2葡萄糖及乳酸代謝實驗 采用特制葡萄糖、乳酸代謝檢測用24孔板。每孔加培養(yǎng)基200 μl，轉(zhuǎn)染后12 h的DU145和PC3細(xì)胞胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，每孔種細(xì)胞10 000個，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱以37 ℃、5%CO2培養(yǎng)72 h后，按照葡萄糖分析試劑盒及乳酸分析試劑盒說明，收集細(xì)胞上清液培養(yǎng)基，測量OD值。根據(jù)按照細(xì)胞數(shù)規(guī)格化的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出所剩余的葡萄糖含量和所產(chǎn)生的乳酸的量。

1.2.3CCK-8實驗 96孔培養(yǎng)板每孔接種2 000個細(xì)胞，按轉(zhuǎn)染試劑說明操作分別加入轉(zhuǎn)染混合液100 μl·孔-1，6 h后換為完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h向每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄熒光實時定量多聚酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 轉(zhuǎn)染48 h后Trizol法提取細(xì)胞總RNA，PKM2 mRNA檢測采用SYBR Green染料法逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR試劑盒，在ABI7300定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算PKM2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5Western Blotting(WB)檢測蛋白表達(dá) 通過Western blotting檢測DU145 和PC3 細(xì)胞中Sp1與PKM2蛋白表達(dá)。提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min變性，冷卻備用。取蛋白樣品50 μg和Marker 5 μl 上樣，80 V 40 min、120 V 120 min 電泳后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶封閉，一抗孵育過夜，洗膜30 min，二抗孵育60 min，洗膜30 min，曝光，通過目的蛋白條帶和內(nèi)參(GAPDH)條帶灰度值計算相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

每組實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件處理。組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖分析試劑盒檢測DU145與PC3消耗葡萄糖能力

與NC組比較，前列腺癌細(xì)胞株DU145與PC3體外轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后，剩余葡萄糖含量顯著偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 乳酸分析試劑盒檢測DU145與PC3產(chǎn)生乳酸的能力

與NC組相比，前列腺癌細(xì)胞株DU145與PC3體外轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后產(chǎn)生乳酸能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

與NC組比較，aP<0.05

圖1 DU145與PC3葡萄糖消耗能力檢測

與NC組比較，aP<0.05

圖2 DU145與PC3產(chǎn)生乳酸的能力檢測

2.3 CCK-8實驗檢測DU145與PC3細(xì)胞活性和增殖能力

轉(zhuǎn)染NC與Sp1 siRNA后分別于24、48、72和96 h向每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，結(jié)果顯示，Sp1 siRNA明顯抑制前列腺癌的細(xì)胞活性和增殖能力。見圖3。

2.4 qRT-PCR檢測DU145與PC3的 PKM2表達(dá)

與NC組比較，前列腺癌細(xì)胞株DU145與PC3體外轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后， PKM2 mRNA的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

與NC組比較，bP<0.01

圖3 DU145與PC3細(xì)胞活性和增殖能力檢測

與NC組比較，bP<0.01

圖4 DU145與PC3的 PKM2表達(dá)檢測

2.5 Western Blotting實驗檢測Sp1的表達(dá)

轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA組與轉(zhuǎn)染NC組相比，轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后Sp1的表達(dá)明顯降低，表明本研究所采用篩選出的Sp1 siRNA 具有較高的沉默效率。見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后Sp1檢測檢測

轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后PKM2的表達(dá)顯著降低，表明Sp1與PKM2具有協(xié)同性，Sp1可以促進(jìn)PKM2的表達(dá)。見圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后PKM2表達(dá)的檢測

3 討 論

目前，對去勢抵抗性前列腺癌仍無特效的治療手段[6]，因此，對去勢抵抗性前列腺癌的增殖代謝研究有重要臨床意義。本研究結(jié)果顯示:在去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞株DU145與PC3中體外轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后，與NC組相比，剩余葡萄糖含量明顯偏高(P<0.05)，乳酸的產(chǎn)生顯著下降(P<0.05)，表明Sp1在前列腺癌中起到促進(jìn)細(xì)胞代謝的作用。CCK-8實驗結(jié)果也表明在前列腺癌細(xì)胞中抑制Sp1則抑制了細(xì)胞增殖能力，說明Sp1在前列腺癌中具有重要的促癌作用[7-9]。為了更好地研究人轉(zhuǎn)錄因子Sp1，有學(xué)者使用大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)尋找到一種能夠快速、高效表達(dá)并且純化出Sp1蛋白的方法[10]，為我們今后進(jìn)一步的研究提供支持。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，抑制Sp1后能夠明顯抑制PKM2的表達(dá)；Western Blotting檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Sp1 siRNA后Sp1表達(dá)顯著降低，表明我們實驗所選用的Sp1 siRNA具有較高的沉默效率，并且伴隨著PKM2的表達(dá)顯著降低，通過qRT-PCR與Western Blotting兩種實驗方法，從mRNA及蛋白水平驗證抑制Sp1可抑制PKM2的表達(dá)。PKM2被認(rèn)為是原型，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中PKM2重新表達(dá),以具有活性的二聚體的形式存在較多，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和代謝。腫瘤細(xì)胞在氧供應(yīng)充足情況下仍產(chǎn)生大量乳酸提示腫瘤的高代謝活性。腫瘤代謝是目前研究的熱點之一，人們期望通過闡明腫瘤高代謝的機制，以控制腫瘤代謝中的關(guān)鍵物質(zhì)為靶點，為開辟治療腫瘤的新途徑提供理論和實驗依據(jù)。

目前，PKM2在前列腺癌中的作用已被逐漸認(rèn)識，PKM2能夠調(diào)節(jié)前列腺癌的葡萄糖代謝[11]。腫瘤細(xì)胞通常表達(dá)的PKM2可導(dǎo)致新陳代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)向有氧糖酵解和腫瘤發(fā)生，高葡萄糖濃度可刺激PKM2的305位賴氨酸乙酰化，乙酰化突變的作用是積累糖酵解中間體和促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長[12]。

有研究證實，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前列腺癌組織中PKM2的表達(dá)明顯高于局灶原發(fā)性前列腺癌組織，Gleason 8-10的前列腺癌組織中PKM2的表達(dá)明顯高于Gleason 6-7的前列腺癌；前列腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞被認(rèn)為具有更高的惡性度，更加具有侵襲與轉(zhuǎn)移特性的前列腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中PKM2的表達(dá)比非前列腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞明顯增高，認(rèn)為PKM2的上調(diào)與前列腺癌的進(jìn)展有關(guān)[13]。有研究表明，miR-124可通過靶向調(diào)控抑制PKM2 基因的表達(dá)從而抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖[14]，抑制PKM2可增強前列腺癌PC3細(xì)胞對藤黃酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性[15]。因此，PKM2在前列腺癌中的作用越來越受到重視。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)Sp1在前列腺癌中起到重要的促癌作用，Sp1可通過PKM2途徑促進(jìn)前列腺癌的增殖和代謝。進(jìn)一步明確了Sp1、PKM2在前列腺癌中相互調(diào)控的分子機制，為以Sp1、PKM2為靶點治療前列腺癌提供了理論依據(jù)， 為以后監(jiān)測前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和治療的有效藥物開發(fā)提供依據(jù)。但Sp1與PKM2的具體機制仍需要我們進(jìn)一步研究，我們推測在前列腺癌中Sp1可能與PKM2 的啟動子區(qū)域結(jié)合，從而促進(jìn)PKM2的表達(dá)，需要我們進(jìn)一步的探索明確。

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Sp1 promotes cell metabolism and proliferation through PKM2 pathway in prostate cancer

LIU Da-chuang1，2，3，LIANG Qing1，TAO Tao2，3，HUANG Ye-qing2，3，XU Bin2，3，CHEN Shu-qiu2，3，ZHANG Zhi-guo1， DONG Yang1， HAN Cong-hui1， CHEN Ming2，3

(1.DepartmentofUrology，XuzhouCentralHospital，AffiliatedtoSoutheastUniversity，Xuzhou221009，China;2.DepartmentofUrology，ZhongdaHospitalAffiliatedtoSoutheastUniversity，Nanjing210009，China;3.SurgeryCentralLaboratory，SchoolofMedicineSoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To determine wether the Sp1 could accelerate the metabolism of prostate cancer cells through PKM2.Methods: DU145 and PC3 cell lines of prostate cancer were transfected with Sp1 siRNA or NC. Aerobic glycolysis was detected by the glucose and lactic acid detection kit after transfection. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. PKM2 mRNA expression was detected by qRT-PCR. Sp1or PKM2 expression was tested by Western Blotting. Results: The remaining glucose level was higher in Sp1 siRNA group than in NC group， the lactic acid level declined significantly after Sp1 siRNA transfection. CCK-8 assay revealed over-expression of Sp1 siRNA significantly inhibited proliferation. qRT-PCR showed that the inhibition of Sp1 could significantly inhibit the expression of PKM2. Western Blotting showed that Sp1 had high efficiency of silence， PKM2 expression reduced significantly after Sp1 siRNA reansfection.Conclusion: Sp1 acts directly on PKM2 to promote cell metabolism in DU145 and PC3 cell lines of prostate cancer.

prostate cancer; specificity protein 1; cell proliferation; pyruvate kinase isoenzyme type M2; aerobic glycolysis

2014-12-18

2015-01-12

國家自然基金(81370849、81300472、81272557、81202034)、臨床醫(yī)學(xué)科技專項——新型臨床診療技術(shù)攻關(guān)基金(BL2013032)、教育部博士點基金(20120092120071)、江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012336、BK2012647)、南京市科技發(fā)展基金(201201053)、江蘇六大人才高峰基金(WSW-067)、江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃基金(CXZZ13_0133)和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項基金資助項目

劉大闖(1980-)，男，安徽亳州人，在讀博士研究生，主治醫(yī)師。E-mail:ldc_32357@126.com

陳明 E-mail:mingchenseu@gmail.com; 韓從輝 E-mail:conghuiseu@126.com

劉大闖，梁清，陶陶，等.前列腺癌中Sp1通過PKM2途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖代謝[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(3)：337-341.

R737.25

A

1671-6264(2015)03-0337-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.001