膽囊Cajal間質細胞的體外分離、培養與鑒定

譚宇彥，王晶敏，王棟，嵇振嶺

(東南大學附屬中大醫院 普外科，江蘇 南京 210000)

·論 著·

膽囊Cajal間質細胞的體外分離、培養與鑒定

譚宇彥，王晶敏，王棟，嵇振嶺

(東南大學附屬中大醫院 普外科，江蘇 南京 210000)

目的:探討兔膽囊Cajal間質細胞(ICC)的原代分離、培養及鑒定的方法。方法:選擇出生后4～5周齡的新西蘭大白兔，經耳緣靜脈注入空氣處死，在無菌條件下取出膽囊，在解剖顯微鏡下剝去膽囊黏膜和黏膜下層，利用Ⅱ型膠原酶消化法分離膽囊原代ICC，接種于含有干細胞因子的M199培養基中進行培養。倒置顯微鏡下連續觀察細胞的形態和生長情況，用酪氨酸蛋白激酶受體c-kit特異性抗體免疫熒光染色進行鑒定。結果：細胞穩定貼壁后，在倒置顯微鏡下觀察可見ICC呈梭形、三角形，有突起；隨著培養時間的延長，突起細長化并彼此相互連接形成網絡。該類細胞c-kit抗體免疫熒光染色呈陽性。結論：成功建立了一套膽囊原代ICC培養的方法，為研究ICC的生物學特性及其與膽囊動力障礙性疾病的關系奠定了基礎。

Cajal間質細胞；膽囊；原代細胞培養

Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是消化道慢波電位的起搏細胞和信號傳導細胞， 主要參與基本電節律的產生和調控，對維持消化道正常運動功能起著決定性作用[1]。ICC的異常與多種消化道動力紊亂性疾病密切相關。膽囊收縮功能障礙是膽囊結石的主要病因，ICC對膽囊運動起著重要的調節作用[2]。分離、培養膽囊原代ICC，是研究ICC功能以及膽囊運動障礙在膽石形成過程中相關機制的基礎。目前，對于膽囊ICC原代培養的報道甚少。我們研究應用酶解法并結合梯度離心技術，對膽囊原代ICC的培養、分離及鑒定進行初步的探討。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

出生后4～5周齡的新西蘭大白兔，購自江蘇省農科院模式動物研究所，雌雄不限。

M119培養基(美國，HyClone公司)，Ⅱ 型膠原酶(美國，Sigma)，胎牛血清(美國，HyClone公司)，重組干細胞因子(美國，Sigma公司)，Ficoll400分離液(美國，Pharmacia公司)，兔抗c-kit多克隆抗體(美國，Santa Cruz公司)，山羊抗兔FITC標記熒光二抗(美國，Santa Cruz公司)，細胞核抗體DAPI(丹麥，DAKO公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1膽囊組織單細胞懸液的制備 新西蘭大白兔經耳緣靜脈注入空氣處死，在無菌條件下迅速切除膽囊，縱行切開將膽汁排凈，用含1%青鏈雙抗的D-Hank′s液沖洗干凈。在解剖顯微鏡下銳性剝離膽囊黏膜及黏膜下層，再用含1%青鏈雙抗D-Hank′s液反復沖洗2～3次，將膽囊剪碎為1 mm×1 mm小塊，放置離心管，加入8 ml Ⅱ 型膠原酶(1.3 mg·ml-1)，37 ℃消化15 min后以1 500 r·min-1離心3 min，去上清液，加入無血清M199培養基5 ml反復吹打3 min，1 500 r·min-1離心5 min，去上清液。用10 ml無血清M199培養基重懸細胞，過200目篩網去除大塊組織，將細胞加在等體積20%Fillcoll 400梯度密度液上，1 500 r·min-1離心5 min，取液面交界細胞沉淀。

1.2.2接種細胞 用M199培養基(含20%FBS，1%青鏈雙抗，SCF 5 ng·ml-1)，將細胞濃度調整至1×106ml-1，接種至6孔板，板中預先放置數鼠尾膠原(2 ng·ml-1)包被的蓋玻片。放入細胞培養箱(37 ℃，O2濃度95%，CO2濃度5%)。細胞穩定培養8 h后換液，沖去未貼壁的細胞，更換M199培養基(成分同上)繼續培養。以后每2天換液1次，注意觀察培養基有無渾濁、顏色變淡、漂浮物和絮狀物等。

1.2.3免疫熒光鑒定 穩定培養1周后，進行免疫熒光鑒定。傾倒培養基，用PBS漂洗5 min×3次，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，PBS漂洗5 min×3次，用5%山羊血清室溫下封閉30 min，加入兔抗c-kit多克隆抗體(1∶100)4 ℃冰箱過夜。次日取出后用PBS漂洗 5 min×3次，加入DAPI染核5 min，PBS漂洗5 min×3次，封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 倒置顯微鏡下ICC形態變化

膽囊原代ICC接種8 h后，在倒置顯微鏡下見ICC貼壁生長，細胞邊界清晰，包體成梭形、紡錘形或三角形，細胞核大，細胞質較少，折光性強，并可見從包體發出的細長突起樣結構(圖1)，但ICC特有的網絡狀結構不明顯，并可偶見少量條帶狀平滑肌細胞。隨著培養時間延長至72 h后，可見ICC通過側突相互接觸成網狀(圖2)。

2.2 熒光顯微鏡下ICC形態學變化

酪氨酸蛋白激酶受體c-kit是ICC特異性標記，通過c-kit抗體免疫染色可以對其進行鑒定。選擇培養至7 d的細胞進行c-kit熒光染色，在共聚焦顯微鏡下觀察，可見胞體呈綠色熒光c-kit染色陽性的長梭形細胞即ICC。DAPI復染細胞核后可見細胞核呈藍色熒光染色(圖3)。

圖1 ICC體外培養8 h光鏡下細胞形態

圖2 ICC體外培養72 h光鏡下細胞形態

圖3 ICC免疫熒光鑒定(c-kit陽性)

3 討 論

ICC是西班牙神經解剖學家Cajal于1893年在胃腸道奧爾巴赫神經叢(Auerbach′s plexus)、深肌層、環行肌層內觀察到的一類特殊的間質細胞[3]，它特異性地表達酪氨酸蛋白激酶受體c-kit，通過c-kit抗體可以對其進行鑒定[4]。目前認為，ICC主要的功能是產生和傳導慢波電位，介導神經信號傳遞，調控消化道運動[5]。研究表明，多種消化道動力障礙性疾病與ICC異常密切相關[6-9]。膽囊結石是消化系統一種常見疾病[10]，ICC數量減少導致的膽囊收縮功能障礙是膽囊結石的主要病因之一[11]。所以，如果能在體外對膽囊原代ICC進行分離、培養和鑒定，對進一步研究ICC的功能、特性以及探討其對膽囊運動功能的影響在膽囊結石形成過程中的作用機制有著重要的意義。

長期以來ICC的體外培養一直是個難點，我們在總結先前學者們的研究基礎上，進行反復的實驗，總結了一些關于膽囊原代ICC培養的經驗。ICC培養有以下幾個問題值得注意:(1) 避免污染。消化道內含有大量的細菌，稍有不慎即可發生污染。我們在實驗中發現，一旦發生污染，細胞折光性降低，伸展、貼壁能力喪失，繼而發生死亡，所以避免污染是ICC成功培養的前提。在實驗過程中，我們在D-Hank′s液和細胞培養基中均加入青鏈雙抗，以減少污染的發生。(2) 縮短膽囊體外存留時間。合理的實驗安排和熟練的操作以縮短組織在體外存留時間是保證細胞存活數量的重要因素。因此，我們在處死動物摘取膽囊后，立即對組織進行處理，盡量縮短體外存留時間。(3) 剝離膽囊黏膜及黏膜下層。肥大細胞是消化道除ICC外唯一表達c-kit的細胞，主要位于黏膜層和黏膜下層，而ICC是位于膽囊肌層內[12]。仔細剝離黏膜和黏膜下層能去除肥大細胞并減少其對ICC鑒定的干擾。(4) 嚴格控制Ⅱ型膠原酶消化時間。Ⅱ型膠原酶消化時間過久對細胞影響較大，國內外文獻報道，提取腸道ICC時酶消化腸道組織時間一般為30 min[13]。我們通過反復實驗發現，在37 ℃下酶消化膽囊組織時間控制在15 min左右為宜，細胞的成活率相對較高。(5) 梯度離心和早期換液。分離原代ICC的同時也夾雜著部分平滑肌細胞，根據細胞沉降系數和貼壁時間不同的特點，我們利用Ficoll400進行梯度離心，并取液面交界的細胞進行培養；因ICC貼壁時間較平滑肌細胞早，接種8 h候后即換液，可以去除貼壁較晚的平滑肌細胞和活力較差的ICC，為貼壁的ICC生長創造良好的環境，同時也提高了ICC的純度。(6) 干細胞因子(Stem cell factor， SCF)的作用。SCF是c-kit的天然配體，對ICC正常生長、表型維持、細胞網絡的穩定起著重要作用[14]。本實驗中，在培養基中加入了5 ng·ml-1的SCF對原代ICC成功培養至關重要。

本實驗成功地對膽囊原代ICC進行分離、培養和鑒定，為今后進一步研究ICC的生理特性以及其在膽囊結石發病中的作用機制研究提供了基礎。然而，該種方法培養的ICC沒有達到較高的純度，目前有學者通過流式細胞儀和免疫磁珠法來純化腸道ICC。我們將繼續研究，以摸索出一套高效、高純的膽囊原代ICC培養方法。

[1] HUIZIMGA J D,CHEN J.Interstitial cells of Cajal:update on basic and clinical science[J].Curr Gastroenterol Rep,2014,16(1):363.

[2] LAVOIE B,BALEMBA O B,NELSON M T,et al.Morphological and physiological evidence for interstitial cell of Cajal-like cells in the guinea pig gallbladder[J].J Physiol,2007,579(2):487-501.

[3] SANDERS K M.Interstitial cells of Cajal at the clinical and scientific interface[J].J Physiol,2006,576(3):683-687.

[4] WARD S M,SANDERS K M.Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal:from bench to bedside.I.Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2001,281(3):602-611.

[5] SANDERS K M,WARD S M.Kit mutants and gastrointestinal physiology[J].J Physiol,2007,578(1):33-42.

[6] JAIN D,MOUSSA K,TANDON M,et al.Role of interstitial cells of Cajal in motility disorders of the bowel[J].Am J Gastroenterol,2003,98(3):618-624.

[7] TONG W D,LIU B H,ZHANG L Y,et al.Expression of c-kit messenger ribonucleic acid and c-kit protein in sigmoid colon of patients with slow transit constipation[J].Int J Colorectal Dis,2005,20(4):363-367.

[8] CHEN Z H,ZHANG Y C,JIANG W F,et al.Characterization of interstitial Cajal.progenitors cells and their changes in Hirschsprung’s disease[J].PLoS One,2014,9(1):e86100.

[9] KIYOHARA T,SHINOMURA Y,ISOZAKI K,et al.A decreased number of c-kit-expressing cells in a patient with afferent loop syndrome[J].J Gastroenterol,2003,38(4):390-394.

[10] 朱麗婭，嵇振嶺，趙剛.完全腹腔鏡聯合膽道鏡保膽手術的護理配合[J].現代醫學,2014,42(2):194-196.

[11] PASTERNAK A,GIL K,MATYJA A,et al.Loss of gallbladder interstitial Cajal-like cells in patients with cholelithiasis[J].Neurogastroenterol Motil,2013,25(1):17-24.

[12] PASTERNAK A,GAJDA M,GIL K,et al.Evidence of interstitial Cajal-like cells in human gallbladder[J].Folia Histochem Cytobiol,2012,50(4):581-585.

[13] XU W D,JIANG X,LAN L,et al.Long-term culture and cryopreservation of interstitial cells of Cajal[J].Scand J Gastroenterol,2012,47(1):89-98.

[14] TONG W,JIA H,ZHANG L,et al.Exogenous stem cell factor improves interstitial cells of Cajal restoration after blockade of c-kit signaling pathway[J].Scand J Gastroenterol,2010,45(7-8):844-851.

Isolation， culture and identification of interstitial cells of Cajal from gallbladderinvitro

TAN YU-yan，WANG Jing-min，WANG Dong，JI Zhen-ling

(DepartmentofGeneralSurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210000，China)

Objective: To investigate the method of isolation， culture and identification of interstitial cells of Cajal (ICC) from the rabbit gallbladderinvitro. Methods: ICC were derived from gallbladder tissue of New Zealand white rabbit by enzymatic dissociation of collagenase type Ⅱ and cultured in M199 medium. The morphological characteristics of ICC was observed with an inverted microscope， and the cell phenotype was identified by immunofluorescence staining using specific antibody against receptor tyrosine kinase c-kit with the confocal microscopy. Results: ICC exhibited a few triangle or spindle shaped axis-cylinders after cells attachment， and the long processes were observed to build synapse and form the net-work structure of cells after 3 days. Cultured ICC were positive for immunofluorescence staining of c-kit antibody. Conclusion: The enzymolysis method for primary culture of ICC from rabbit gallbladder is feasible， which may provide a basis for research into the biological function of ICC and the relationship between the ICC and gallbladder motility disorders.

interstitial cells of Cajal; gallbladder; primary cell culture

2014-12-18

2015-01-28

江蘇省科技計劃基金資助項目(7790000049)

譚宇彥(1978-)，男，湖南湘潭人，在讀博士研究生，副主任醫師。E-mail:tyytyz@sina.com

嵇振嶺 E-mail:zlji@vip.sina.com

譚宇彥，王晶敏，王棟，等.膽囊Cajal間質細胞的體外分離、培養與鑒定[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(3)：390-393.

R657.42

A

1671-6264(2015)03-0390-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.014