椎間盤髓核細胞表型的研究進展

蔡峰，吳小濤，王鋒

(東南大學醫學院附屬中大醫院 脊柱外科，江蘇 南京 210009)

·綜 述·

椎間盤髓核細胞表型的研究進展

蔡峰，吳小濤，王鋒

(東南大學醫學院附屬中大醫院 脊柱外科，江蘇 南京 210009)

髓核細胞特異性表型是識別髓核細胞和研究其生物學行為的基礎，同時也是基因干預、細胞移植等生物學修復椎間盤退變的前提。髓核細胞兼有軟骨細胞和脊索細胞的表型特點，而特定基因的轉錄和表達調控又廣泛受到椎間盤局部微環境以及椎間盤退行性變的影響。部分髓核細胞亞群還具有祖細胞的生物學特性并表達特定的表型。對髓核細胞表型的研究有助于推動椎間盤退變生物學治療的進展。

椎間盤退變；髓核細胞表型；軟骨細胞；脊索細胞；髓核祖細胞；文獻綜述

椎間盤退行性變是一個多因素參與的對椎間盤成分、結構、功能漸進性破壞的慢性過程。近年來，采用細胞移植、基因干預和細胞因子注射等生物學治療手段來恢復髓核細胞的數量和功能是研究的熱點[1-2]。但目前對髓核細胞表型的認識仍局限于其表達軟骨表型：Ⅱ型膠原(COL2)和聚集蛋白聚糖(ACAN)。干細胞移植后是否能分化成為真正的髓核細胞，仍缺少鑒定的標準。因此，對髓核細胞表型特征的全面認識，有助于指導生物學治療。作者就髓核細胞表型的研究進展作一綜述。

1 髓核細胞表型

1.1 髓核細胞表達軟骨表型

2002年Sive等首次在人椎間盤細胞中檢測出軟骨細胞表型COL2、ACAN和SOX9基因[3]。他還發現在正常髓核細胞中三者表達呈強陽性，而纖維環中略微表達或不表達;在退變椎間盤髓核細胞中依然能表達SOX9，但是COL2和ACAN表達明顯降低，尤其是ACAN。盡管關節軟骨細胞、纖維環細胞和髓核細胞中均表達COL1，且表達量在3種細胞中差異不明顯，但是結合COL2和ACAN的表達，仍能將髓核細胞與其他椎間盤細胞相區別[4]。此外，Clouet等[4]還分別比較了兔關節軟骨細胞、纖維環細胞和髓核細胞中COL2/COL1、COL2/ACAN的兩個比值，發現在關節軟骨和髓核細胞中，COL2/COL1值遠遠大于纖維環細胞(關節軟骨細胞≈1 800，髓核細胞≈1 000，纖維環細胞≈1)，說明在關節軟骨和髓核細胞中主要以COL2為主，而纖維環中則以COL1為主。在關節軟骨細胞中COL2/ACAN值又遠遠大于髓核細胞(關節軟骨細胞≈1 100，髓核細胞≈1)，提示高表達ACAN是髓核細胞的顯著特征。

1.2 髓核細胞表達脊索細胞的表型

脊索細胞是胚胎發育過程中脊索的殘留物，細胞體積較大(直徑30～40 μm)，通常以團狀出現，細胞內含有空泡，至少占細胞總體積的25%。在人類，脊索細胞隨著年齡的增加而丟失，青春期以后就很難檢測到，然而在鼠類、兔子等動物體內這些細胞卻能長久保留。

有研究顯示，盡管成人髓核中罕見具有空泡特征的脊索樣髓核細胞存在，但卻能檢測到脊索細胞特征性表型分子表達，如：T基因，細胞角蛋白-8、-18、-19(CK-8、-18、-19)，半乳凝素-3(Gal-3)，配對盒基因1(PAX1)和叉頭盒基因1(FOXF1)。T基因(又稱Brachyury)編碼的蛋白質是一個胚胎期的核轉錄因子，影響中胚層形成和分化所需基因的轉錄[5]。這個蛋白存在于脊索來源的細胞中，被認為是在胚胎期或脊索瘤中調節軟骨形成，是脊索分化和生長過程所必需的[6]。

Minogue等[7]利用密度梯度離心法分離牛髓核細胞和脊索細胞，并用RT-PCR檢測兩種細胞中T基因的表達，發現T基因在脊索和髓核細胞中均表達，兩者差異不超過10倍，同時在髓核細胞中的表達遠遠大于關節軟骨(≈100倍)和AF(≈50倍)，并且其表達量不因髓核退變程度的增加而減少。

此外，髓核細胞還表達CK-8、-18、-19，Gal-3等脊索細胞表型，盡管與脊索細胞相比，其表達量在髓核細胞中略低，但差異不超過10倍[7-10]。然而，在髓核細胞CK-8、-18、-19的表達遠遠大于在纖維環(CK-8≈2 544倍，CK-18≈1 860倍，CK-19≈50倍)和關節軟骨(CK-8≈7 600倍，CK-18≈15 990倍，CK-19≈36倍)[7]。這些基因在髓核、纖維環和關節軟骨細胞間的差異表達使它們可能成為髓核細胞特征性的表型。T基因，CK-8、-18、-19以及Gal-3的高表達不僅可以將髓核細胞與纖維環細胞或軟骨終板細胞相區別，而且在一定程度上提示髓核細胞來源于胚胎發育過程中脊索細胞在椎間盤內的殘留[7]。

胚胎發育過程中椎間盤以及髓核組織的形成受到嚴格的信號調控。Choi等發現，表達shh基因的脊索細胞形成髓核組織，但對纖維環和終板的形成不是必須的[11]。在沒有shh參與下，髓核細胞就不能表達其表型，而纖維環和終板軟骨細胞則能表達，但有所減少[12]。研究發現， PAX1和FOXF1這兩個基因的表達是由shh信號軸激活的[13]。PAX1參與胚胎期調節椎間盤生成，FOXF1與椎間盤細胞生長、增殖有關[14-15]。在人髓核細胞中，PAX1和FOXF1基因的表達量分別是軟骨細胞的2 000倍和100倍。PAX1和 FOXF1在髓核細胞和軟骨細胞中的表達差異進一步提示，髓核細胞起源于脊索細胞，并繼承了脊索細胞的表型特征。

1.3 髓核細胞表達環境相關性基因

髓核細胞中表達一些與椎間盤缺血缺氧環境相關的基因，比如低氧誘導因子-1α(HIF-1α)、葡萄糖轉運蛋白-1(GULT-1)、血管內皮生長因子(VEGF-A)、碳酸酐酶-12(CA12)和血紅蛋白β鏈(HBB)。HIF-1是低氧誘導結合蛋白，是一種堿基-螺旋-環袢-螺旋PAS異二聚蛋白質，有α、β兩個亞基構成。富氧狀態下HIF-1α很快被降解，而缺氧狀態下HIF-1α穩定，并進入細胞核，與HIF-1β結合后激活下游基因的轉錄。Rajpurohit比較了髓核、纖維環和終板軟骨中HIF-1的表達情況，發現在三者中均表達HIF-1β，但是只有在髓核細胞中表達HIF-1α[16]。GULT-1、VEGF-A和CA12受HIF-1α的調控，三者在髓核細胞中高表達，而在纖維環和軟骨細胞中低表達或不表達，GULT-1能夠提高髓核細胞攝取葡萄糖能力，用以糖酵解和合成糖蛋白，VEGF-A具有促血管生成和促有絲分裂的作用，CA12是髓核細胞表面分子，用以維持細胞內pH值[17-18]。

1.4 髓核細胞表面特征性的CD分子

研究發現，髓核細胞特征性地表達一些CD分子，高表達CD24、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，幾乎不表達CD34、CD14、CD45和CD133(表1)，其中CD24被認為是髓核細胞特異性的標記[19]。Fujita等[20]發現，CD24在人髓核細胞的表達水平遠遠大于纖維環、軟骨、骨、皮膚等9種組織，并且在突出髓核與正常髓核中表達無明顯差異。另外，他們還發現在脊索細胞來源的脊索瘤組織中高表達CD24，而間葉組織來源的軟骨瘤組織卻不表達CD24。

1.5 髓核細胞鑒定時的陰性標記

Minogue等[9]運用基因芯片和RT-PCR技術篩選出4個在人關節軟骨細胞中表達遠遠大于髓核細胞中表達的基因：生長分化因子10(GDF10)、骨唾液酸糖蛋白(IBSP)、細胞因子1(CYTL1)、纖蛋白1(FBLN1)。這些基因在關節軟骨和髓核細胞中表達差異在100倍以上，因此，Minogue認為這些基因在髓核細胞中表達陰性而在關節軟骨細胞表達陽性，是鑒定髓核細胞的陰性標記。

表1 CD分子在髓核細胞中表達情況

2 正常和退變髓核細胞中表型差異

退變髓核細胞通過調控某些基因的表達量，最終使細胞內分解代謝增加，合成代謝減少，細胞功能減退。其中表達上調的基因主要有骨母細胞特異性因子-2(periostin)、COL1、基質Gla蛋白(MGP)、FBLN1、基質金屬蛋白酶-2和-9(MMP-2、-9)，下調的基因主要有COL2、ACAN、SOX9、突觸小體相關蛋白(SNAP25)、神經-鈣黏素CDH2和CK-8、-18、-19[21-22]。

Periostin是一種細胞外基質蛋白，具有細胞黏附功能，在組織生長和損傷修復過程中促進膠原產生和有效交聯，但同時Periostin還與整聯蛋白αvβ3結合，誘導下游基因磷酸化，最終導致成纖維細胞過度表達COL1，促使病變組織纖維化[21]。此外，Periostin與MMP-2前體結合，能促進其水解，形成有活性的MMP-2，兩者在退變髓核細胞中表達量顯著增加并且成正相關[21]。MGP是一種表達于骨和軟骨中的維生素K依賴蛋白，在軟骨內成骨、病理性鈣化和骨折愈合過程中上調表達。隨著髓核細胞的逐漸老化，MGP的表達增加，Lee等發現，在年輕人(<54歲)髓核細胞中用免疫組化法不能檢測出MGP表達，而在退變的老年人髓核細胞中可以檢測到MGP的表達[8，10]。FBLN1在正常髓核細胞和纖維環細胞中幾乎不表達，但是在退變椎間盤細胞中表達明顯增加。FBLN1能增強血小板反應蛋白-1 (ADAMTS-1)分解蛋白多糖的能力，減少細胞外基質中蛋白多糖的含量，加速椎間盤退變的發展[7]。

SOX9、COL2、ACAN 3個基因是經典的軟骨細胞表型，在退變髓核細胞中，三者表達明顯降低[3，21]。SOX9是軟骨表型的主要調控基因，能有效促進ACAN的表達，在椎間盤退變中SOX9表達下降以及MMP表達升高，COL2和ACAN合成減少，分解增加。Minogue等首次發現在牛髓核細胞中表達SNAP25和CDH2，而在關節軟骨中幾乎不表達，并且隨著椎間盤的退變，髓核細胞中SNAP25和CDH2的表達量逐漸降低[7]。SNAP25參與細胞膜融合和胞吐過程，CDH2在間充質性凝聚物和軟骨形成過程中起重要作用，但是兩者在髓核細胞中的作用還不明確。

3 髓核祖細胞表型

近年來，越來越多的研究認為在椎間盤中可能存在髓核祖細胞，這種細胞與軟骨樣髓核細胞不同，它具有增殖能力，表達增殖細胞核心抗原PCNA，并且具有多向分化潛能。髓核祖細胞表達胚胎干細胞或間充質干細胞特征性的表型，比如Oct3/4、Sox2、Nanog、CD133、C-KIT、CD166(ALCAM)、Notch1和Jagged1。這些基因在細胞增殖和分化中起調控作用，使髓核祖細胞能夠維持干細胞的一些特性。

Oct3/4、Sox2和Nanog是調節胚胎干細胞基因轉錄的3個具有代表性的轉錄因子，Oct3/4在胚胎干細胞中處于調節細胞全能性的頂層位置，其與Sox2、Nanog通過參與LIF-STAT、BMP、Wnt等信號傳導通路，對胚胎干細胞中的管家基因進行調控，從而保持胚胎干細胞的全能性[23-24]。Erwin等發現，Oct3/4、Sox2、Nanog這3個基因在髓核祖細胞中表達，并且其在髓核祖細胞中的表達量比MSC中高[25]。

CD133、C-KIT、CD166(ALCAM)是MSC和造血祖細胞的特征性表面標記，他們參與維持干細胞的自我更新和增殖。Yasen發現，在兔髓核祖細胞中CD133、C-KIT、CD166(ALCAM)在RNA和蛋白水平均有明顯表達，同時隨著年齡的增加，表達量下降。因此，這3個基因也可以作為髓核祖細胞的鑒定標記[26]。

Notch信號傳導途徑在無脊椎動物和脊椎動物中廣泛存在且高度保守。此途徑介導由局部細胞間相互作用而產生的、對多種不成熟細胞分化的抑制信號， 在胚胎發育中起重要作用。Notch1、Jagged1是參與Notch信號傳導的蛋白分子，它們在髓核祖細胞中的表達，抑制髓核祖細胞的分化，使其保持干細胞特性[26]。

此外，Sakai利用甲基纖維素半固體培養基進行集落形成實驗，發現在髓核中表達酪氨酸激酶受體(Tie2)和雙唾液酸神經節苷脂(GD2)的細胞具有增殖能力和分化潛能，因此,他認為這類細胞就是髓核祖細胞。進一步研究發現在髓核中存在如圖1所示的分化過程[27]。

圖1 髓核祖細胞分化過程

其中Tie2+GD2-CD24-和Tie2+GD2+CD24-是具有多向分化能力的祖細胞，他們都表達間充質干細胞特征性的分子CD271(>75%)[28]。CD24是髓核細胞表型，當CD24陽性時，髓核祖細胞即已分化成穩定的髓核細胞。

4 間充質干細胞向類髓核細胞分化

目前用于治療椎間盤退變的干細胞主要有：骨髓間充質干細胞(BM-MSC)、脂肪干細胞(AD-MSC)和滑膜干細胞(SMSC)。這些細胞在一定的誘導條件下能分化成類髓核細胞，上調COL2與ACAN合成。

研究發現，人BM-MSC在殼聚糖-甘油磷酸水凝膠中誘導后或者移植入牛椎間盤后，細胞成類髓核分化，COL2/ACAN值接近于髓核細胞，并且不表達成骨細胞和肥大細胞特征性表型[29]。Minogue將AD-MSC和BM-MSC誘導分化后用RT-PCR和免疫組化法檢測髓核細胞陽性標記COL2A1、ACAN、PAX1及FOXF1，陰性標記IBSP、FBLN1，結果顯示兩種細胞均上調表達COL2A1、ACAN、PAX1、FOXF1，但是BM-MSC同時上調表達IBSP、FBLN1，表現出類似于軟骨細胞的特點，而AD-MSC卻不表達[9]。以上結論在一定程度上說明，AD-MSC分化后與髓核細胞的標記更吻合，進而推斷AD-MSC可能是更適合的種子細胞。體外研究已證實SMSC在與髓核細胞共培養時具有類髓核分化能力[30]，但是其分化后的表型譜目前暫無報道。綜上所述，深入認識髓核細胞的表型特征有助于理解間充質干細胞在髓核微環境中的分化過程與修復機制。

5 展 望

目前關于鑒定髓核細胞還沒有一個統一的標準，髓核細胞在椎間盤中具有軟骨樣細胞作用，同時又表達脊索細胞特性，并且在椎間盤特殊的微環境中表達特定的表型。這些特性是未來確定髓核細胞表型的基礎。此外，不容忽視的是髓核中存在髓核祖細胞，這類細胞可能是未來椎間盤退變生物學治療的重要種子細胞。

目前用于椎間盤退變生物學治療的種子細胞主要是間充質干細胞，雖然它可以分化為具有功能的類髓核細胞，但是這種類髓核細胞與正常髓核細胞的表型特點并不能完全吻合。因此，對髓核細胞表型的準確全面認識，是未來進一步尋找最適種子細胞以及探索其最適分化條件的前提。

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2014-11-01

2014-12-29

國家自然基金資助項目(81272035，81201423)；中央高校基本科研業務費專項資金和江蘇省普通高校研究生科研創新計劃資助項目(KYLX_0202)

蔡峰(1987-)，男，江蘇吳江人，在讀博士研究生。E-mail: cfspine@163.com

吳小濤 E-mail: wuxiaotao@medmail.com.cn

蔡峰，吳小濤，王鋒.椎間盤髓核細胞表型的研究進展[J].東南大學學報:醫學版，2015，34(3)：443-447.

R681.53

A

1671-6264(2015)03-0443-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.028