艾拉莫德(T-614)對類風濕關節炎患者外周血單個核細胞凋亡和IL-8趨化因子免疫調節作用實驗研究*

西安市第五醫院檢驗科 (西安 710082 )

鄭 杰 王曉元△ 劉 丹▲ 楊良勤 陳慶平

艾拉莫德(T-614)對類風濕關節炎患者外周血單個核細胞凋亡和IL-8趨化因子免疫調節作用實驗研究*

西安市第五醫院檢驗科 (西安 710082 )

鄭 杰 王曉元△劉 丹▲楊良勤 陳慶平

目的：檢測艾拉莫德(T-614)對類風濕關節炎(RA)外周血單個核細胞(PBMC)誘導凋亡作用及IL-8細胞因子水平變化，探討T-614對RA治療的免疫機制。方法：收集風濕免疫科診斷明確的活動期RA患者，采集全血，處理收集PBMC。制備T-614，使用不同劑量T-614，為高劑量組、中等劑量組和低劑量組與PBMC共培養，孵育1h、3h，通過流式細胞儀檢測PBMC凋亡，并收集上清檢測IL-8水平。結果：T-614與PBMC共孵育培養，T-614高劑量、中劑量與空白對照組PBMC凋亡率為1h:12.30±2.45%、8.23±2.29%和4.71±2.01%，3h：25.47±4.19%、13.39±3.80%和7.88±2.71%，各組比較使用T-614低劑量，中等劑量與PBMC共孵育培養24h收集上清，ELISA法檢測IL-8水平，T-614中、低劑量與空白對照組分別為48.91±8.33μg/ml、125.31±20.02 μg/ml和155.36±22.15μg/ml。結論：隨著T-614濃度升高，對PBMC細胞凋亡成劑量依賴性趨勢，同時降低細胞分泌因子IL-8水平。免疫調控誘導 PBMC凋亡、降低趨化因子IL-8水平可能是T-614治療RA的重要機制。

類風濕性關節炎( Rheumatoid arthritis, RA) 是一種進行性、侵蝕性關節炎為主要表現的全身性自身免疫疾病，在我國的患病率為0.2%～0.4%。艾拉莫德(Iguratimod，T-614)一種新型開發的抗風濕藥物，治療RA具有高效、不良反應少等特點，作為抗風濕二線藥在關節炎的治療中逐步體現出較佳的療效，但其確切的治療機制尚不清楚。本研究通過檢測T-614對類風濕關節炎(RA)外周血單個核細胞(PBMC)誘導凋亡作用，以及IL-8細胞因子水平變化，探討T-614對RA治療的免疫作用機制。

資料與方法

1 一般資料 收集2013年10月至2014年2月在西安市第五醫院就診的RA患者12例，男性2例，女性10例，年齡20～65歲，病程2月至10年。診斷均符合1987年美國風濕病協會(ACR)修訂的診斷分類標準，且未使用過艾拉莫德治療?；颊逥AS28評分≥3.2分，為病情活動期，患者均簽署知情同意書。

2 主要試劑和儀器 Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒，購自美國Biolegend公司，人淋巴細胞分離液購自MP. Biomedicals公司，RPMI 1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司，Human IL-8 Immunoassay ELISA試劑盒，購自北京盛基瀚森科技有限公司，艾拉莫德(T-614)由先聲藥業公司惠贈，FACS Calibur流式細胞儀產自美國Becton Dickinson公司，酶標儀為美國BioTek公司。

3 方 法 艾拉莫德(T-614)(先聲藥業公司惠贈)每片25mg，粉碎后，溶解在2ml的DMSO中，震蕩20min后，過40μm篩網，配置成10mg/ml，分裝EP管中，細胞培養應用DMEM液稀釋10倍使用微孔過濾器過濾分裝使用。

3.1 細胞分組處理：患者靜脈血10ml入肝素抗凝管中，采用密度梯度分離法，分離PBMC后，用RPMI 1640培養液(含10%的胎牛血清)調整細胞數至2×105/ml，接種于24孔培養板，每孔1ml細胞混懸液，5%CO2培養箱孵育。將每例PBMC設7個孔進行處理：空白對照組(無藥物干預)，T-614高劑量組(500μg/ml)、中等劑量組(50mg/ml)，共培養分別為1h和3h，檢測PBMC凋亡。T-614中等劑量組(50μg/ml)組、T-614低劑量組(5μg/ml)組培養24h，染色進行CD3+T 細胞IFN-γ表達檢測及收集上清檢測IL-8水平。

3.2 流式細胞術檢測PBMC的凋亡：分別收集培養箱孵育1h、3h及24h后的培養細胞，吹打混勻，將細胞混懸液收集在流式管里，1200r/min，離心8min，收集培養上清液，置于-80℃冰箱備ELISA檢測。細胞制備：加入PBS液，1200r/min，離心5min，洗滌2次，棄上清。加入1×Annexin-Binding Buffer液100μl，將細胞混勻，在暗室內冰上操作。每管加4μl Annexin V-FITC和1μl的PI工作液(1∶4稀釋)。室溫，孵育15min。加1×Annexin-Binding Buffer液150μl，輕柔混勻，1h內上機檢測樣本。

3.3 ELISA檢測IL-8水平：根據Human IL-8 Immunoassay ELISA試劑盒說明書進行操作，對收集的細胞培養上清液進行檢測：以空白孔設為零值，以450nm為檢測波長，以630nm為參考波長，測吸光值。繪制標準曲線,計算出樣品中IL-8的含量。

結 果

1 T-614干預PBMC細胞形態學改變 T-614不同劑量干預PBMC，對1h、3h干預的PBMC進行臺盼藍染色，鏡下可見正常PBMC圓形狀態良好，包膜清晰，臺盼藍染色呈蘭色染色為凋亡壞死細胞，可見細胞大小不等，破碎壞死等見圖1。

圖1 與T-614共培養后PBMC臺盼藍染色[A:正常對照組;B:1h空白對照組(未加T-614)；C：1h中等劑量組(T-614 50μg/ml);D:1h高劑量組(T-614 50μg/ml);E:3h中等劑量組(T-614 50μg/ml)；F：3h高劑量組(T-614 500μg/ml)?！?00倍]

2 流式細胞儀檢測PBMC凋亡結果 共孵育1h和3h，凋亡細胞百分比空白對照組與T-614高、中等劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。T614高與中等劑量組比較差異有統計學意義(P<0.05),見圖2、表1。

3 細胞培養上清液檢測 ELISA檢測上清IL-8水平，T-614中等和低劑量組與對照組比較，IL-8水平明顯減低(P<0.05)，見表2。

圖2 各組PBMC凋亡細胞流式細胞儀檢測結果

表2 共培養24h上清各組IL-8結果的比較 (±s)

討 論

RA是一種慢性的全身自身免疫性病，目前國內外尚無特異的有效治療方法。艾拉莫德(T-614)為新型的口服的小分子DMARDs藥物，在RA疾病中的治療作用越來越受到重視[1]。多項研究表明，由于RA患者自身免疫功能紊亂，自身淋巴細胞過度增生激活本文采用RA的PBMC進行研究，結果顯示，T-614可以誘導RA患者PBMC凋亡，且呈劑量依賴性，提示T-614對患者淋巴細胞的免疫調節功能。從而減輕誘導疾病加重的全身及關節局部炎癥反應，改變了病程，與以往的臨床治療療效觀察結果相符[2]。

活化的淋巴細胞分泌IL-8等是重要的免疫炎癥因子，在RA的發病中起到非常重要的作用，IL-8是多形核中性粒細胞有效的趨化因子，能增加人單核細胞炎性細胞因子的釋放，趨化包括TNF-、IL-6、IL-1β等細胞因子，可以進一步介導炎癥反應，激活粒細胞發生變形、游走和聚集，在炎癥部位產生浸潤作用。本研究得出，隨著T-614劑量增加，PBMC上清的IL-8水平逐步下降，提示了T-614有抑制PBMC分泌IL-8的作用，且呈濃度依賴性，故考慮經T-614治療后，患者血清中IL-8水平可能減低，炎性趨化能力減弱，具有減輕患者全身關節炎癥反應的治療作用。上述研究結果提示，T-614治療RA的免疫抑制可能為誘導了活動期RA患者PBMCs的凋亡，抑制細胞因子IL-8分泌，而達到改善癥狀，控制病情的作用。

[1] Mucke HAM. Iguratimod: A new disease-modifying antirheumatic drug[J]. Drugs of Today,2012, 48(9): 577.

[2] 劉 丹，陳 妤，丁漢飛，等.艾拉莫德(T-614)在類風濕關節炎基礎實驗與臨床療效的研究進展[J].中國新藥雜志，2013，22(9):1052-1055.

(收稿：2015-01-13)

The effects of Iguratimod(T-614) on the apoptosis of peripheral blood mononuclear cells and the secretion of IL-8 in rheumatoid arthritis patients

Department of Rheumatology, The Fifth Hospital of Xi’an (Xi'an 710082)

Zheng Jie Wang Xiaoyuan Liu Dan et al

Objective:To observe the effect of Iguratimod (T-614) on the apoptosis of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), the expression of IL-8 in rheumatoid arthritis (RA) patients, and to explore the possible mechanism of T-614 in treating RA. Methods: 12 patients were diagnosed with RA referred to the Department of Rheumatology. PBMCs were prepared from 12 patients in active stage of RA and treated with T-614 at different concentrations (lower dose: 5 μg/ml; Moderate dose: 50 μg/ml; Higher dose: 500μg/ml ) for 1h and 3h Flow cytometry (FCM) were performed to examine the apoptosis of PBMCs.the secretion of IL-8 in the culture supernatant of treatment group and control group was tested by ELISA after treated with T-614 for 24h. Results: We found that iguratimod effectively induced apoptosis in PBMCs. The apoptosis rates of PBMCs treated with T-614 for 1h were T-614 8.23±2.29% for 50 μg/ml and 12.30±2.54% for 500 μg/ml. The apoptosis rates of PBMCs treated with T-614 for 3h were 13.39±3.80% for 50 μg/ml and 25.30±4.19% for 500 μg/ml. Levels of IL-8 in the culture supernatant of T-614 treated group and control group were tested by ELISA. Iguratimod effectively inhibit IL-8 prodcution, 48.91±8.33 μg/ml for T-614 50 μg/ml, 125.31±20.02μg/ml for T-614 5 μg/ml and 155.36±22.15 μg/ml for the control group (treated without T-614).Conclusions: The results suggest that T-614 induced the apoptosis of PBMCs and inhibited the secretion of IL-8 in peripheral blood. It might be the possible mechanism of the effect of T-614 in treatment of RA.

Arthritis rheumatoid/immunology Apoptosis Monocytes Chemotactic factor IL-8

*陜西省衛生廳科研資助項目(2012D25)

甘肅省科技廳資助項目(144FKCA060)

關節炎，類風濕/免疫學 細胞凋亡 單核細胞 趨化因子類 白細胞介素-8

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.007

△蘭州大學第二醫院

▲通訊作者