腦爾康對AD模型小鼠學習記憶及腦內AchE活性影響的拆方研究*

馬新欣 李 璽 田 苑 王 娟

西安交通大學醫學院第二附屬醫院心理精神科(西安 710004)

·實驗研究·

腦爾康對AD模型小鼠學習記憶及腦內AchE活性影響的拆方研究*

馬新欣 李 璽Δ田 苑 王 娟▲

西安交通大學醫學院第二附屬醫院心理精神科(西安 710004)

目的：對復方中藥腦爾康進行拆方研究，篩選出治療阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease ，AD)模型小鼠藥味精簡，療效較佳的組方。方法：70只小鼠隨機分為7組，每組10只，采用腹腔注射氯化鋁(AlCl3)溶液建立AD模型小鼠，空白組和模型組每天給予生理鹽水0.5mL灌胃；其余各組每天分別給予相應藥物14.3g/kg劑量灌胃，連續30d。觀察各組小鼠學習記憶情況，并測定其右側皮質、海馬區AchE活性及其蛋白水平。結果：各用藥組與模型組比較，全方及拆方1號學習記憶功能明顯改善(P?0.05或P?0.01)，海馬、皮質區AchE活性均明顯降低(P?0.01)，其蛋白水平均明顯升高(P?0.05或P?0.01)；各拆方組分別與全方比較，拆方1號海馬、皮質區AchE活性降低，其蛋白水平升高程度與全方無明顯差異，拆方2，3，4號則均與全方有統計學差異(P?0.05或P?0.01)；拆方2，3，4號與拆方1號比較，除拆方2號在提高海馬區蛋白水平與拆方1號無明顯差異外，其余各組均與拆方1號有統計學差異(P?0.05或P?0.01)。結論：拆方1號及全方改善AD模型小鼠學習記憶，抑制腦內AchE活性作用明顯優于其他拆方組，兩者療效相當，且前者藥味精簡。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經元退行性病變，臨床表現為進行性認知、語言及行為障礙，最終大腦皮質及皮質下功能喪失致患者死亡，其發病機制不明確，中醫藥是重要治療手段之一[1]。院內制劑復方中藥腦爾康膠囊(陜衛藥制劑注字920138號)，由人參、黃芪、益智仁、何首烏、熟地黃、丹參、川芎、石菖蒲、冰片組成，益腎健腦、活血化瘀、補腎生髓，臨床用于抗癡呆治療多年[2]。但腦爾康藥味繁多，如何研制出處方更精練，療效較佳，符合現代中藥特色的抗癡呆新藥目前尚處在探索階段。本文通過動物實驗分析腦爾康拆方組對AD模型小鼠學習記憶障礙及大腦右側皮質、海馬中乙酰膽堿酯酶(Acetylcholine Esterase，AchE)活性的影響，以旨為創制新藥提供實驗依據。

1 材料與方法 1.1 動物與材料 清潔級小鼠70只，昆明種，雄性，體重30±2.8g(西安交大醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(陜)08-004)。人參、黃芪、川芎、丹參、益智仁、熟地黃、何首烏、石菖蒲、冰片等生藥飲片，西安交大第二醫院藥房提供；結晶氯化鋁分析純(AlCl3·6H2O)，天津津北精細化工有限公司提供；AchE測定試劑盒、蛋白定量測試盒、蛋白標準液均為南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實驗設備 跳臺儀(西安交通大學醫學院動物試驗中心提供)，721E型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司KJ0104102706)，臺式離心機，低溫冰箱。

1.3 實驗方法 1.3.1 動物分組：70只小鼠適應性飼養7 d后分隨機為7組：空白組、模型組、腦爾康全方組、拆方1號組(人參、川芎、熟地黃、冰片)、拆方2號組(黃芪、丹參、何首烏、石菖蒲)、拆方3號組(人參、丹參、何首烏、冰片)、拆方4號組(人參、丹參、益智仁、冰片)。小鼠隨機分進各組，每組10只(在喂養及藥物干預過程中有個別小鼠死亡)。在室溫(22±2)℃、濕度40%～50%條件下自由進食飲水。

1.3.2 藥品制備：按文獻[3]，黃芪70g，熟地黃、何首烏各35g，人參、川芎、丹參、益智仁、石菖蒲各23g，冰片2.3g。傳統水煎，使含生藥1g/mL，各拆方組生藥量同腦爾康全方，煎法相同，經115℃高壓滅菌20min，4℃保存備用；AlCl3固體物粉末溶于雙蒸水，濃度配制為10g/L，經0.25μm雙層超濾膜過濾待用。

1.3.3 動物造模：按文獻[4]，除空白組外，各組小鼠以AlCl3溶液100mg/kg腹腔注射，隔日1次，共40d，造成AD模型；空白對照組則以生理鹽水0.5 mL腹腔注射，隔日1次，共40d。結束后采用跳臺法進行學習記憶測試。

1.3.4 給藥方法：學習記憶測試次日給藥。空白組及模型組給予生理鹽水0.5mL/d灌胃；經劑量估換計算，其余各組給予相應藥物14.3g/kg/d劑量灌胃，共30d。結束后再次采用跳臺法進行學習記憶測試。

1.3.5 學習記憶測試：采用跳臺法，測試儀器為跳臺儀，將被試小鼠放入其中，5 min后，將其放于測試儀器的平臺上，當其跳下四肢接觸銅柵時給予25 V 電壓刺激。學習成績的潛伏期為其逃至平臺的時間(s)，學習成績的錯誤次數為5 min 內觸電次數。24 h 后再次進行測試，記憶成績的潛伏期為再次跳下被電擊的時間(s)，記憶成績的錯誤次數為3 min 內觸電次數。

1.4 觀察指標 在冰面上準確分離海馬及皮質后，分別稱取海馬及皮質組織重量，放入勻漿器中，加9倍生理鹽水制成10%勻漿，4℃，3500r/min離心10min，取上清液用化學比色法測定AchE活性，同時測蛋白濃度。

2 結 果 2.1 鋁鹽對小鼠學習記憶的影響 見圖1。與空白組比較，各組學習記憶錯誤次數及學習記憶潛伏期均有明顯差異(P?0.05或P?0.01)。表明慢性鋁中毒對各組小鼠學習記憶均造成一定障礙。

2.2 腦爾康拆方對AD模型小鼠學習記憶障礙的影響 見圖2。①與模型組比較，全方、拆方1號學習與記憶錯誤次數明顯減少(P?0.01)，各用藥組學習潛伏期均明顯縮短(P?0.05或P?0.01)，記憶潛伏期延長(P?0.01)；②與全方比較，拆方1號學習記憶錯誤次數及潛伏期與其無明顯差異，拆方2，3，4號學習記憶錯誤次數、學習潛伏期與其存在明顯差異(P?0.01)，拆方3，4號記憶潛伏期與其存在明顯差異(P?0.01)，拆方2號記憶潛伏期與其無明顯差異。表明拆方1號與全方在改善學習記憶障礙方面療效較佳，且無明顯差異。

2.3 腦爾康拆方對AD模型小鼠海馬和皮質組織AchE活性及其蛋白水平的影響 見表1。①與空白組比較，模型組海馬、皮質組織AchE活性均明顯升高(P?0.01)，蛋白水平均明顯降低(P?0.05或P?0.01)。②與模型組比較，全方、拆方1號海馬、皮質組織AchE活性均明顯降低(P?0.01)，其蛋白水平均明顯升高(P?0.05或P?0.01)。③拆方2，3，4號海馬、皮質組織AchE活性，蛋白水平均無明顯差異。④與全方比較，拆方1號在促進腦蛋白的合成、抑制AchE活性方面與全方組無明顯差異；拆方2，3號僅在促進腦蛋白合成與全方組無明顯差異；拆方4號僅在促進海馬區蛋白合成與全方組無明顯差異。⑤與拆方1號比較，除拆方2號在海馬區蛋白的生成與拆方1號無明顯差異外，其余各組在促進其蛋白合成，抑制AchE活性方面均有顯著性差異(P?0.05或P?0.01)；拆方2，3，4號各個組間比較，均無明顯差異。

表1 腦爾康拆方對AD 模型小鼠腦內AchE活性及其蛋白水平的影響

注：與空白組比較，ΔP?0.05，▲P?0.01；與模型組比較，◇P?0.05，◆P?0.01；與全方組比較，□P?0.01；與拆方1號組間比較，■P?0.05，○P?0.01

3 討 論 AD發病機制復雜，腦內膽堿能神經系統的退行性變被認為是造成AD的最重要病理因素之一。目前已公認[5]，學習記憶與中樞膽堿能神經系統關系極為密切，中樞膽堿能通路是構成學習記憶的主要通路。Ach是其中維持高級神經活動的一種重要神經介質，AchE的作用是水解Ach生成膽堿和乙酸，在終止神經傳遞中起著重要作用。近年來研究也進一步證明[6]，老化與AD病人腦組織AchE活性顯著升高，造成Ach含量不足，導致中樞神經系統功能障礙，出現學習和認知能力下降甚至喪失。因此測定腦組織中AchE活性，可判斷腦內Ach含量變化。鋁能抑制膽堿的轉運，促進乙酰膽堿的分解，降低神經乙酰膽堿轉移酶的活性，提高腦內AchE活性。核酸和蛋白質是大腦記憶功能的物質基礎，鋁可能通過抑制腦組織蛋白質和核酸的合成而降低學習記憶功能[7]。

腦爾康中人參、黃芪為君藥；益智仁、何首烏、熟地黃為臣藥；丹參、川芎為佐藥；石菖蒲、冰片為使藥。本實驗采用君臣佐使化裁法[8]進行拆方，結果顯示，各拆方組均能不同程度改善慢性鋁中毒致AD模型小鼠學習記憶障礙，抑制海馬及皮質AchE活性，提高其蛋白水平。其中拆方1號及全方組作用明顯優于其他拆方組(P?0.05或P?0.01)，兩者療效相當，但前者藥味精簡。拆方1號之所以能與全方組藥效相當，可能與人參、川芎、熟地黃、冰片四味藥物效果較強，藥物間協同作用更強等有關。現代藥理學證明，人參提取物主要成分人參皂甙Rb1能提高大鼠學習記憶能力，減輕AD大鼠海馬及皮質神經元的Tau蛋白磷酸化水平，并能上調學習記憶相關蛋白表達[9]。劉長安等[10]研究證明，川芎嗪可降低大鼠原代海馬神經元細胞高級糖化終產物受體(RAGE)的表達，有效抑制神經元活性氧產生，使海馬神經元在Aβ的毒性作用下其細胞存活率上升，改善AD大鼠腦組織炎性，進而發揮其抗癡呆及神經保護作用。安紅梅等[11]研究熟地黃可縮短D-半乳糖衰老模型大鼠Morris水迷宮中找到平臺時間，提高模型大鼠腦組織SOD、NOS活性，減少MDA、LPO含量，減少SA-β-gal陽性表達細胞數，從而改善衰老模型大鼠學習記憶能力。

本實驗旨在通過拆方研究減少復方制劑中的非藥效因素，提高制劑水平，使復方腦爾康膠囊處方更為精簡，療效較佳，從而節約資源，降低成本，符合目前國內中藥復方創制新藥的常用方法和科研思路，為拆方后的新方進行毒理學和藥效學研究打下實驗基礎，推動新藥研究，促進中藥發展。如何更好地融會貫通中醫與現代醫學的理論并將其用于指導中藥方劑的拆方研究，如何通過更客觀全面的觀察指標分析拆方研究，有待進一步改進。

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(收稿2015-01-23；修回2015-03-05)

Experimental study on decomposing prescription of Naoerkang to effect the learning and memory and AchE activity in the brains of AD mice

The Psychology and Psychiatry department，the Second Affiliated Hospital of Xi’ an Jiaotong University (Xi’ an 710004)

Ma Xinxin Li Xi Tian Yuan et al

Objective：Decompose the Naoerkang to screen one decomposed prescription which has better effect but has fewer ingredients on Alzheimer’s Disease mice. Methods：70 mice were randomly divided into 7 groups，10 for each group，injected AlCl3solution into stomach to made the AD model. Mice of the control and the model groups had been forced to drink saline 0.5mL per day; and mice of the other groups had been forced to drink the response medicine，14.3g/kg per day，for 30 days. observed the learning and memory ability and AchE activity in right cortex and hippocampus in each mouse. Result：Compared with the model group，the whole group and decomposed 1 improved the learning and memory functions obviously(P?0.05 orP?0.01)，decreased the AchE activity obviously(P?0.01)，increased the protein level evidently(P?0.05 orP?0.01) in hippocampus and cortex. All of its decomposed prescriptions compared with the whole group，there were no significant differences existed in decomposed prescription 1 and the whole group，there were significant differences existed in decomposed prescription 2，3，4 and the whole group(P?0.05 orP?0.01). Compared with the decomposed prescription 1，there were significant differences (P?0.05 orP?0.01) existed in decomposed prescription 2，3 and 4 except for increasing the protein level in hippocampus of decomposed prescription 2. Conclusions：decomposed prescription 1 and Naoerkang groups both have better effect of improving the learning and memory functions and inhabiting the AchE activity than any other decomposed prescription，they have the same effect，but the former has fewer ingredients.

NaoErkang Alzheimer’s disease Learning and memory AchE activity Decomposing prescriptions

*陜西省科技發展攻關項目[2007K15-05(3)]

Δ通訊作者：西安交通大學醫學院第二附屬醫院老年病科(西安710004)

▲第四軍醫大學西京醫院檢驗中心(西安710032)

腦爾康 阿爾茨海默病 學習記憶 乙酰膽堿酯酶活性 拆方研究

R741

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.081