牙髓血運重建術對延遲再植牙根部組織bFGF及PDGF表達的影響*

西安市中心醫院口腔科(西安710004)

張 新 劉艷麗?

牙髓血運重建術對延遲再植牙根部組織bFGF及PDGF表達的影響*

西安市中心醫院口腔科(西安710004)

張 新 劉艷麗?

目的：研究牙髓血運重建術對延遲再植的犬年輕恒牙根部組織堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及血小板衍生生長因子(PDGF)表達的影響。方法：選擇4只約5月齡健康雜種犬，取11、13、15、41、43、45恒牙為實驗組，對側同名牙為對照組。1d后實驗組再植后行牙髓血運重建術，對照組再植后不做附加處理。軟食分籠喂養3、6月時拔除實驗牙并取牙槽窩新鮮血液1m1離心，凍融后檢測bFGF及PDGF含量并進行統計學分析。結果：術后實驗牙有3個未形成血凝塊，7個三氧化物凝聚體(MTA)充填不佳，5個出現牙槽骨Ⅱ-Ⅲ°吸收，3個根折。3、6個月時實驗組bFGF和PDGF的濃度升高，與對照組比較差異有統計學意義， bFGF濃度無統計學差異(P>0.05)，而PDGF的濃度隨時間變化呈有統計學差異。結論：牙髓血運重建術可以促使牙根發育、根尖孔閉合、根管壁增厚。但其長期療效，生物學機制，以及可能出現的不良影響仍需繼續研究。

牙外傷是口腔常見病之一[1]。在牙外傷病例中，牙完全脫位約占12%～26%[2]，牙齒脫落后第一時間不能就診并且或在保存脫落牙齒方面沒有經驗會造成患牙缺失，而牙齒再植術后常出現牙根外吸收[3,4]，嚴重時導致牙槽骨吸收、牙松動、牙脫落而造成治療失敗。牙髓血運重建術(Dental pulp revascularization)是由Iwaya等[5]在2001年首次提出，作為治療年輕恒牙牙髓感染或壞死的新選擇，通過徹底的根管清理、消毒，保護牙髓干細胞和間充質干細胞，為增殖和分化提供良好的環境，并使用MTA進行冠方封閉。當根管內血管再生后，根尖周炎癥可以逐漸愈合，出現根尖閉合、牙根長度增加及管壁增厚等現象，但其分子機制仍不明確。本研究擬通過建立犬牙髓血運重建術動物學模型，觀察延遲再植的年輕恒牙根部組織堿性成纖維活細胞生長因子(bFGF)以及對血小板衍生生長因子(PDGF)的表達情況以及不同時期牙髓血運重建術bFGF以及PDGF的影響作用，對牙延遲再植術后牙根周組織炎癥吸收愈合機制提供理論依據，為深入研究牙髓血運重建術的臨床應用奠定基礎。

材料和方法

1 實驗動物及分組 4只本地約5月齡健康雜種犬，雌雄不限，體重約6kg，選取11、13、15、41、43、45恒牙為實驗組(再植后行牙髓血運重建術)，同名對側牙做為對照組(再植后不做附加處理)。納入標準：經X線影像確定牙根未發育完成、根尖孔敞開的上頜和下頜單根管牙齒。排除標準：牙根已發育完成、牙冠或牙根存在裂隙。篩選出46顆牙(其中實驗組和對照組各1顆下前牙牙根已發育完成，未納入試驗)進行試驗。

2 主要試劑和儀器 bFGF、PDGF酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物公司，中國)；MTA(登士柏公司，美國)；牙科X射線機(北京普朗公司，中國)；口腔顯微鏡(蔡司公司，德國)。

3 實驗方法 拔除犬實驗牙后靜置于生理鹽水培養皿中，1d后將實驗牙置于2 mmol/L濃度的ALN溶液中浸泡10 min，進行再植。實驗組牙齒常規開髓、拔髓、預備至25#針并徹底消毒，將實驗組牙植入對應原牙槽窩中，刺激根尖周組織緩慢出血，顯微鏡下觀察出血達到釉牙骨質界后停止刺激，靜置15min后觀察到血凝塊形成后使用MTA墊底封閉和玻璃離子充填修復。對照組牙齒浸泡后直接植入對應原牙槽窩。術后使用羊腸線逐個拉攏縫合唇舌側牙齦固定牙齒。

4 標本制備 分籠喂養軟食3、6月時分別將兩只實驗狗進行標本制備。首先實驗牙拍攝X線片后拔除該牙，牙槽窩取新鮮血液1m1靜置于離心管，3h后4000rpm離心15min并用移取血清至空離心管，-70℃保存。標本收集完成后進行檢測，以避免試劑和人員產生的誤差影響。

5 ELISA檢測 按試劑盒要求進行ELISA檢測，終止操作后測定各孔的吸光度(OD450值)，每組重復測試3次，計算均值。根據標準品的濃度及OD值計算標準曲線方程后算出樣品濃度。

6 統計學方法 運用SPSS方法21.0統計學軟件，P<0.05認為差異有統計學意義。

結 果

1 臨床檢驗 標本制備的過程中，3顆實驗牙刺激后無法形成血凝塊，排除本實驗。喂養結束時牙齒叩診呈金屬音，牙齦無明顯退縮、充血以及水腫，松動1度內的實驗牙進行制備。3月時2只實驗犬由于損壞或松動脫落共喪失4顆牙齒(實驗組1顆，對照組3顆)，最后，實驗組10顆，對照組8顆受試牙被納入進行比較研究；6月時實驗組8顆，對照組6顆受試牙進行比較研究。

2 X線觀察結果 術前實驗牙根尖孔均開放。喂養3月時22個實驗牙牙根中有3個MTA充填不佳，2個出現牙槽骨2～3度吸收，1個牙根根折；6月時24個實驗牙牙根中有4個MTA充填不佳，3個出現牙槽骨2～3度吸收，2個牙根根折，均不進行標本制備。其余實驗牙部分出現根尖孔、牙根管壁厚度縮窄的趨勢(圖1,圖2)。

圖1 CBCT再植牙血運重建術后1d 圖2 CBCT再植牙血運重建術后6m

3 ELISA檢測結果 與對照組比較，實驗組3、6個月時bFGF及PDGF的濃度升高，有統計學差異(P<0.05)。實驗組組內按時間比較時顯示bFGF濃度無統計學差異(P>0.05)，而PDGF的濃度隨時間變化呈現統計學差異(P<0.05)，見表1，表2。

表1 不同時間點實驗、對照組bFGF濃度水平

注：與對照組比較，*P<0.05

表2 不同時間點實驗、對照組PDGF濃度水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與3月比較，△P<0.05

討 論

外傷引起的年輕恒牙脫落會造成牙根停止發育、根管內壁變薄、根尖孔不能閉合等問題。以往的治療中，脫落牙齒完成根管治療及再植后使用氫氧化鈣或礦化三氧化聚合體(MTA)進行誘導根尖成形，可以促進根尖孔閉合，形成鈣化屏障[6,7]，但氫氧化鈣的使用容易造成微滲漏和牙根折裂[8]，而MTA的作用是使根尖孔原位關閉、牙齒失去感覺及防御功能，繼發性牙本質無法形成，治療后根管仍然需要充填。但這兩種方法均不能促進牙根的繼續生長及根管壁增厚[8～10]。

血管再生法是一種治療死髓、外傷等年輕恒牙疾病的新方法，Banchs等[11]對壞死感染的年輕恒牙聯合應用甲硝唑，米諾環素和環丙沙星沖洗液進行徹底消毒，刺激根尖組織出血充盈根管，血凝塊形成后采用MTA封閉冠方，術后2年發現根尖病變愈合，根尖閉合以及管壁增厚，部分患者出現牙髓活力反應。近年來的研究表明[12]部分采取血管再生法的病例取得了良好的治療效果。

牙髓血管再生取得成功的關鍵包括徹底消毒、良好的血凝塊以及嚴密的冠方封閉。本實驗對于實驗牙采用ALN溶液浸泡，治療后又使用3%次氯酸鈉液蕩洗以保證消毒的徹底。血凝塊作為組織生長的支架[13]，含有PDGF、bFGF和組織生長因子等可以刺激未分化的間充質細胞分化的因子。本實驗刺激根尖出血時，使用口腔顯微鏡可以有效的控制血凝塊的形成過程，為嚴密封閉根管提供有效保障。本實驗有3顆實驗牙未形成血凝塊，分析可能原因有：①過強的根尖刺激，無法控制出血量；②藥物刺激性過強造成根尖感染：③局部血運不佳無法形成血凝塊。MTA的正確使用是冠方封閉的保證， MTA一般充填在根管口下方2～3mm的釉-牙骨質界。本實驗共有7個MTA充填不良而失敗的牙齒，推測可能是因為犬牙冠部為錐形，根管口的直徑小且移行不明顯，操作不當或血凝塊質量不佳都有可能造成MTA推進根管的情況。

bFGF是一種肝素粘合多肽的成纖維生長因子，具有促進創傷組織愈合，修復軟硬組織等作用。相關研究表明， bFGF 與牙本質基質的沉積及成釉細胞 成牙本質細胞的分化成熟有關。PDGF是一種多肽生長因子，參與各種炎癥反應、細胞增殖以及組織修復等過程，也可與破骨細胞受體結合促進破骨細胞對骨的吸收，同時誘發釋放前列腺素類物質促進血管擴張，使局部組織發生充血反應，有利于傷口早期修復。同時，PDGF也是一種促進有絲分裂以及生物趨化因子，可調節成骨細胞功能，刺激成骨細胞復制，降解膠原，促進骨形成。本實驗通過ELISA實驗檢測不同時期牙槽窩新鮮血液中bFGF和PDGF的含量，結果顯示實驗組3、6個月時bFGF和PDGF的濃度升高，差異有統計學意義。實驗組組內按時間比較時顯示bFGF濃度無統計學意義，而PDGF的濃度隨時間變化呈現統計學差異。該結果表明，通過血管再生法進行延遲再植的實驗牙根尖周出現新血管和牙體硬組織生成，對于延遲再植的效果有著積極的作用。

牙髓血管再生是近年來出現的新型治療方法，可以有效縮短治療時間，促使牙根發育、根尖孔閉合、根管壁增厚。但牙髓血管再生的長期效果、生物學機制以及可能出現的不良影響仍需繼續研究，本實驗為該項技術的臨床應用奠定基礎。

[1] Ruslin M, Wolff J, Boffano P,etal. Dental trauma in association with maxillofacial fractures: an epidemiological study[J]. Dent Traumatol, 2015,31(4):318-323.

[2] 周珊紅. 方絲弓矯治器固定脫位牙的臨床療效觀察[J]. 陜西醫學雜志,2014,43(10):1352-1354.

[3] Correa-Faria P, Ramos-Jorge ML, Martins-Junior PA,etal. Malocclusion in preschool children: prevalence and determinant factors[J]. Eur Arch Paediatr Dent, 2014,15(2):89-96.

[4] 常群安. 牙外傷完全脫位再植術32例[J]. 陜西醫學雜志,2009,38(08):1097.

[5] Iwaya S I, Ikawa M, Kubota M. Revascularization of an immature permanent tooth with apical periodontitis and sinus tract[J]. Dent Traumatol, 2001,17(4):185-187.

[6] Panzarini SR, Sonoda CK, Saito CT,etal. Delayed tooth replantation: MTA as root canal filling[J]. Braz Oral Res, 2014,28(1):1-7.

[7] 杜 莉. 兒童乳牙竇道型慢性根尖周炎284例[J]. 陜西醫學雜志,2012,41(08):1034-1035.

[8] Marao HF, Panzarini SR, Manrrique GR,etal. Importance of clinical examination in dentoalveolar trauma[J]. J Craniofac Surg, 2012,23(5):e404-e405.

[9] Bortoluzzi EA, Souza EM, Reis J M,etal. Fracture strength of bovine incisors after intra-radicular treatment with MTA in an experimental immature tooth model[J]. Int Endod J, 2007,40(9):684-691.

[10] Broon NJ, Bortoluzzi EA, Bramante CM. Repair of large periapical radiolucent lesions of endodontic origin without surgical treatment[J]. Aust Endod J, 2007,33(1):36-41.

[11] Banchs F, Trope M. Revascularization of immature permanent teeth with apical periodontitis: new treatment protocol[J]. J Endod, 2004,30(4):196-200.

[12] Dudeja PG, Grover S, Srivastava D,etal. Pulp Revascularization- It's your Future Whether you Know it or Not?[J]. J Clin Diagn Res, 2015,9(4):R1-R4.

[13] Maeda H, Ichihashi K, Fujii T,etal. Oral administration of hydrolyzed rice bran prevents the common cold syndrome in the elderly based on its immunomodulatory action[J]. Biofactors, 2004,21(1-4):185-187.

(收稿：2015-09-16)

The effects of bFGF and PDGF expression in pulp revascularization. Department of Stomatology,Central Hospital of Xi’an

(Xi’an 710004 )

Zhang Xin Liu Yanli

Objective： To study the effects of pulp revascularization on the expression of bFGF and PDGF in the root tissue of young permanent dog teeth through delayed tooth replantation .Methods:4 dogs with immature teeth aged approximately 5 months were selected. The experimental group contained 11，13，15，41，43，45 and the teeth in other side as the control group. The replantation was proceeded 24 hours later when pulp revascularization was finished in experimental group and none treatment in control group. Statistical analysis was performed to detect bFGF and PDGF content after 3 and 6 months feed. Results:There were 3 blood clots without formation of, 7 poor MTA filling, 5 alveolar bone absorption of II or III degree and 3 root fracture. The concentration of the bFGF and PDGF in experimental group was increased and was significant different with the control group in 3 and 6 month. There was no significant difference in the experimental group on the concentration of bFGF according to the time comparison, while the concentration of PDGF had significant different. Conclusion:Pulp revascularization is a new treatment for delayed tooth replantation. It’s a long term effect mechanism, biology, human tissue, the mechanism of molecular biology and possible adverse effects still need to study for clinical application in the future.

Tooth/Immature @Pulp revascularization Tooth delayed replantation

*陜西省科學技術研究發展計劃項目(2014K11-03-08-04)

牙/解剖學 @牙髓血運重建術 牙再植術

R781.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.004

?通訊作者：第四軍醫大學口腔醫院口腔急診與綜合臨床科