芍藥苷預處理通過干預NF-κB信號通路對在體大鼠MIRI發揮保護作用*

西安市第九醫院(西安 710054)

高宇勤 郝霽萍? 劉美林 趙國平▲

芍藥苷預處理通過干預NF-κB信號通路對在體大鼠MIRI發揮保護作用*

西安市第九醫院(西安 710054)

高宇勤 郝霽萍?劉美林 趙國平▲

目的：探究芍藥苷預處理通過干預NF-κB信號通路對大鼠在體心肌缺血再灌注損傷的干預作用。方法：結扎SD大鼠心臟冠狀動脈(LDA)建立在體MIRI模型，利用0.5 %Evan’s 藍灌注心肌及1 %TTC 磷酸緩沖液孵育心肌以觀察心肌壞死；Western blot探究芍藥苷預處理對NF-κB信號通路的影響。結果：芍藥苷藥物預處理組(心梗面積0.13±0.04)與缺血再灌注組(0.360.06)比較，心梗面積明顯減小(P<0.01)；芍藥苷預處理抑制NF-κB蛋白的表達，能降低I-κB磷酸化，升高非磷酸化I-κB蛋白表達。結論：芍藥苷預處理降低大鼠在體MIRI模型的梗死面積、減輕炎癥表達，可能通過抑制NF-κB蛋白的表達，降低I-κB磷酸化，升高非磷酸化I-κB蛋白表達而實現。

目前研究認為NF-κB 活化是心肌缺血再灌注早期眾多細胞因子表達的始動因素,NF-κB轉錄后促進細胞因子如ICAM-1、TNFα等表達，進而造成組織的炎癥損傷[1]。抑制NF-κB激活，有助于減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制急性炎癥反應。所以研究藥物預處理干預此環節以求減輕心肌的MIRI是個研究熱點。芍藥苷對腦缺血損傷具有保護作用[2]。但是對于MIRI的研究較少，是否干預NF-κB信號通路，目前沒有相關研究。本實驗采用在體SD大鼠冠狀動脈前降支(LAD)結扎術建立模型來觀察芍藥苷預處理是否通過干預NF-κB信號通路而發揮心肌保護作用。

材料和方法

1 試劑與儀器 芍藥苷購于南京澤朗醫藥公司(批號:ZL20090409SYG), NF-κB抗體，pI-κB(ser32/36)抗體，I-κB抗體購自SANTA CRUZ公司; 其余皆為國產試劑。

2 動物模型 SPF 級雄性SD(30只)大鼠，體重280～400g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。許可證號：SCXK(粵)2008-0002，2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉，行氣管插管，接呼吸機，呼吸頻率60次/min、通氣量20ml/kg。縱形剪開第三肋骨，鈍性分離胸腔，顯露心臟，確定縫扎位置(肺動脈圓錐與左心耳交界處下方2mm)。用0號線，疊一個0.8～1mm的凹槽硅膠管，結扎LAD，缺血30min后，復灌2h。模型復制的可靠性以ECGⅡ導聯ST段抬高為心肌缺血存在，以ST段回落1/2為再灌注成功。本實驗建模總共有4只SD大鼠因為麻醉和手術原因死亡，死亡率13%。

3 分組及給藥方案 30只雄性SD大鼠被隨機分為3組,每組10只，3組分別為：假手術組(此組只開胸，但不結扎LAD)、缺血再灌注組、藥物預處理組。

藥物預處理組給予芍藥苷100mg/kg灌胃，1d/1次，連續4d，最后一次于手術前30min給予。其他兩組給予等量生理鹽水。

4 心肌梗死面積測定 原位結扎左冠狀動脈主干，經主動脈逆行灌注 0.5 %Evan’s 藍 2～3 ml , 立即取心臟，沖洗，將左室與其他心肌組織分離，快速置于液氮中，取出冷凍心臟，延左室長軸方向連續環切，每片2～3mm，正常心肌為藍色，缺血心肌為粉色，將無藍染心肌置入1 %TTC中 37 ℃孵育20min ,壞死區呈灰白色 ,非壞死區呈深紅色 ,分離兩部分 ,濾紙吸干,稱重。梗死面積以壞死區重量與壞死區與非壞死區重量之和之比表示。

5 心肌組織HE染色 再灌注結束后，剪下心臟，洗凈，分離左心室前壁缺血區，切取3～5mm3組織，10%中性甲醛固定12h，脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、染色及中性樹膠封片，鏡下觀察。

6 蛋白印跡(Western blot)檢測 檢測NF-κB、I-κB蛋白，上液蛋白總量80μg，檢測pI-κB蛋白,上液蛋白量為120μg。轉膜條件：350 mA恒流濕轉45min。一抗孵育條件：anti-NF-κB(1∶1000)，anti-I-κB(1∶1000)，Anti-GAPDH(1∶2000), anti-pI-κB(1∶500)4 ℃ 孵育過夜，二抗(1∶5000)。用ECL 發光液，涂膜，蓋片，曝光，Quantity one軟件分析 Western blot 條帶的灰度值。

結 果

1 芍藥苷預處理對心肌梗死面積 本實驗利用0.5 %Evan’s 藍灌注心肌及1 %TTC 磷酸緩沖液孵育心肌來觀察心肌壞死。芍藥苷預處理組與缺血再灌注組比較，心梗面積明顯減小(P<0.01)。

2 芍藥苷預處理對心肌組織病理的影響 HE染色觀察芍藥苷預處理對在體大鼠MIRI心肌病理形態的影響(見附圖)。缺血再灌注組大鼠心肌纖維排列紊亂，心肌間質水腫，充血、出血，心肌橫紋不清或消失，細胞核腫脹甚至銷蝕、脫失，而芍藥苷預處理組的大鼠心肌損傷較缺血再灌注組心肌纖維結構較輕，心肌間質輕度水腫，部分核染色呈深染改變。組織病理學提示芍藥苷預處理可以減輕缺血再灌注損傷。

附圖 芍藥苷預處理對大鼠心肌組織病理的影響

3 芍藥苷預處理對缺血再灌注損傷模型大鼠心肌NF-κB信號通路的影響 蛋白印跡(Western blot)觀察芍藥苷預處理對大鼠心肌NF-κB信號通路的影響。缺血再灌注組中，胞漿及胞核內的NF-κB蛋白含量明顯高，而且磷酸化的pI-κB蛋白也明顯高，而非磷酸化I-κB明顯低，而芍藥苷預處理組的上述蛋白表達明顯相反，差別達到統計學意義，分別為(P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.01)。

討 論

NF-κB是一種具有基因轉錄多向調控作用的轉錄因子，以失活狀態存在于胞質中。當各種配體與受體結合后使I-κB磷酸化及pI-κB升高，隨后NF-κB活化后進入細胞核，在核內與靶基因的特異序列結合并動轉錄，促進細胞因子如ICAM-1、TNFα等的生成，造成內皮、心肌細胞的損傷以及炎癥損傷[3]。通過下調心肌組織NF-κB和pI-κB，升高I-κB的表達，可以減少心肌炎癥反應及組織損傷。研究發現芍藥苷[4]可降低BAX及Caspase-3的表達，上調BCL-2的表達，減少心肌細胞凋亡及心肌梗死面積，但是對于NF-κB信號通路的影響，缺乏文獻報道，本實驗利用0.5 %Evan’s 藍灌注及1 %TTC 孵育心肌，發現芍藥苷能減少大鼠MIRI模型的心梗面積，同文獻報道相符[4]；組織病理學觀察也應證了芍藥苷預處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷程度。同時實驗發現，芍藥苷預處理能抑制胞漿內的NF-κB蛋白的表達，并減少細胞核內NF-κB蛋白含量，同時芍藥苷預處理增加非磷酸化I-κB蛋白表達，減少磷酸化pI-κB蛋白表達，證明芍藥苷預處理通過抑制NF-κB信號通路而發揮心肌保護作用。

[1] Lu M, Tang F, Zhang J,etal.Astragaloside IV attenuates injury caused by myocardial ischemia/reperfusion in rats via regulation of toll-like receptor 4/nuclear factor-κB signaling pathway[J].Phytother Res,2015,29(4):599-606.

[2] Xiaofei Li, Zhibin Wen, Xiaofan He,etal. Effects of Cinnamic Acidon Expression of Tissue Factor Induced by TNFα in Endothelial Cells and its Mechanisms[J]. J Chin Med Assoc,2006,69(5):207-212.

[3] Yuan X, Niu HT, Wang PL,etal.Cardioprotective Effect of Licochalcone D against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Langendorff-Perfused Rat Hearts[J].PLoS One. 2015,10(6):e0128375.

[4] Nizamutdinova IT, Jin YC,Kim JS, Yean MH,etal. Paeonol and paeoniflorin, the main active principles of Paeonia albiflora, protect the heart from myocardial ischemia/reperfusion injury inrats[J]. Planta Med,2008,74(1):576-584.

(收稿：2015-07-15)

*國家自然科學基金(81173189)

心肌缺血/并發癥 再灌注損傷 NF-κB @芍藥苷

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.005

西安市衛生局科技項目(2013022)

西安科技項目(SF1416)

▲暨南大學醫學院

?通訊作者