基于ITS與factor 1-alpha序列桉樹焦枯病菌的雙重PCR快速檢測

張 靜，麻文建，朱天輝

（四川農業大學林學院，成都 611130）

桉樹具有生長周期短、易存活、適生范圍廣、輪伐期短、用途多樣化等優點，在我國秦嶺淮河以南地區被大規模的引種和栽培，尤其以四川、云南、廣東、廣西、福建、湖南、貴州為主要栽培區［1］。國內外目前對桉樹病害的報道較多，主要以桉樹花斑病（Aureobasidiumsp.）［2］、炭疽病（Colletotrichumgloeosporioides）［3］、紫斑病（Septoriamortarlensis）［4］、灰霉病（Botrytiscinerea）［5］和桉樹焦枯病［6］等葉部真菌性病害發生較為普遍，其中由麗赤殼屬（Calonectriade Not）真菌引起的桉樹焦枯病危害最為嚴重，分布最廣泛［5］。桉樹焦枯病作為一種世界性病害，已成為威脅桉樹的首要病害。桉樹焦枯病主要發生在桉樹苗木和4年生以下幼樹上。受焦枯病病原菌侵染后，輕者出現桉樹植株葉片脫落，苗圃與幼林落葉、枯梢、枝條萎蔫等癥狀；重者則會出現感病苗木葉片全部脫落、頂枯、植株枝條全部枯死等現象［7］。在我國引起桉樹焦枯病的麗赤殼屬真菌主要為C.quinqueseptata和C.morganii，而C.morganii主要分布在我國西南地區。鑒于該病害的嚴重性及分布的局部性，原林業部于1996年1月5日把桉樹焦枯病列入國內森林植物檢疫對象［8］。

目前，國內外對桉樹焦枯病菌的研究主要集中在病原菌形態學鑒定、分類、生物學特性、遺傳性狀、化學防治等方面，對于桉樹焦枯病菌的快速檢測暫無報道。因此，建立快速有效的分子生物學檢測手段具有重要意義。Batuman 等［9］、Henriquez等［10］、Deng 等［11］分別利用PCR 以及基于PCR 的快速檢測技術對番茄褪綠病毒（Tomatochloroticspotvirus）、菜豆根腐病（Fusariumcuneirostrum）和甘薯褪綠斑病毒（Sweetpotatochloroticfleckvirus）進行了有效的前期判斷。本文以引起四川桉樹焦枯病的病原菌（Calonectriamorganii）為對象，建立了基于麗赤殼屬（Calonectria）真菌以及Calonectria morganii病原菌的快速檢測技術，并成功應用于田間不同發病程度桉樹中病原的檢測，為桉樹焦枯病的早期診斷和提前防治提供重要的技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及菌絲的收集

試驗所用供試菌株名稱、寄主、來源、數量詳見表1，其中10號參試菌株的屬名代表麗赤殼屬（Calonectria）的無性階段。將供試菌分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）平板上，于28 ℃下培養7d后用打孔器在菌落2／3邊緣處打孔，制備直徑為5mm 大小的菌餅，分別轉接至瓶裝量為200mL的馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）的三角瓶中，置于28℃搖床，140r／min，振蕩培養8d。用滅菌紗布過濾菌絲體，收集菌絲，滅菌蒸餾水沖洗3次，冷凍干燥，存入已滅菌EP管中，-20 ℃保存備用。

表1 供試菌株及其來源Table 1 Tested strains and its sources

1.2 供試菌株DNA 提取

供試菌株DNA 的提取：菌絲基因組DNA 的提取參照韓振云等［12］的方法。取30mg冷凍干燥的菌絲于研缽中，加液氮后迅速研磨，至菌絲呈白色粉末狀后快速轉移至2mL離心管中，加1mL預熱的裂解緩沖液混合均勻，置于65 ℃水浴鍋中保溫1h左右；12 000r／min，4℃離心10min，取上清液，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1（體積比）混合有機溶劑，于12 000r／min，4 ℃再次離心10min，后取上清液；重復上述步驟2次；最后加入2倍體積的預冷無水乙醇和1／10體積3mol／L的醋酸鈉溶液，-20 ℃沉淀1h后于12 000r／min，4℃再次離心10min，棄上清液；75%的乙醇沖洗3次，待晾干后加入25μL dd H2O 溶解沉淀；加 入100μL TE（10 mmol／L Tris，1mmol／L EDTA）溶解DNA；吸取5μL DNA 溶液用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，其余DNA樣品置于-20℃冰箱備用。

樣品組織DNA 的提取：在焦枯病發病期從桉樹栽培園區內采集健康和發病的葉片組織，用刀切成2cm×2cm 大小的樣塊，75%乙醇消毒后用蒸餾水沖洗3次，晾干，稱取100mg已處理過的新鮮發病葉片置于研缽中用液氮研磨成粉末，進行DNA的提取，后續提取步驟同上。

1.3 Calonectria屬ITS區特異性引物設計與合成

利用真菌rDNA 基因ITS區通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對Calonectria屬真菌進行PCR擴增，擴增體系（50μL）：10×PCR buffer 5.0μL，25mmol／L的MgCl23μL，10mmol／L dNTP 1.5μL，10mmol／L的引物ITS1／ITS4 各1.5μL，5 U／μLTaq酶0.3μL，模板DNA 4.0μL，加滅菌ddH2O補足體積至50μL，同時以加ddH2O 代替DNA 模板組做陰性對照。反應程序為：94 ℃預變性5min；94 ℃變性40s，56 ℃退火40s，72 ℃延伸45s，32個循環；72 ℃延伸7min。反應結束后，取5μL 樣品于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30 min（100V），經EB染色后，在凝膠成像系統上觀察并拍照。

PCR 產物送往上海生工生物工程公司進行測序。根據測序結果，結合GenBank中已知Calonectria屬菌株的ITS 序列，比對后利用軟件Primer Premier 6.0，在Calonectria屬真菌ITS保守區內進行該屬特異性引物設計，通過基因庫BLAST 比對驗證引物的特異性。引物合成委托上海生工有限公司完成。合成的引物序列為：CYS1 5′-CCAGAGGACCCAACAAAC-3′；CYS2 5′-CCAGAGCGAGGTGTATTAC-3′。目的片段擴增大小為351bp。

1.4 Calonectria morganii factor 1-alpha（tef1）區特異性引物的設計與合成

利用Calonectria屬真菌factor 1-alpha（tef1）區基因通用引物，EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和EF2［5′-GGA（G／A）GTACCAGT（G／C）ATCATGTT-3′］對C.morganii進行常規PCR 擴增。PCR 擴增體系（50μL）：10×PCR buffer 5.0 μL，MgCl23 μL，10 mmol／L dNTPs 1.5μL，EF1-728F（10mmol／μL）1.5μL，EF2（10mmol／μL）1.5μL，Taq聚合酶（5U／μL）0.3μL，ddH2O 33.2μL，模板DNA 4.0μL。PCR反應條件：94℃熱啟動5min；94℃變性40s；56℃退火40s；72 ℃延伸45s；循環32 次；72 ℃延伸10min。

PCR 產物送往上海生工生物工程公司進行測序。根據測序結果，結合GenBank中已知Calonectria屬菌株的factor 1-alpha（tef1）基因序列，比對后利用軟件Primer Premier 6.0 進行C.morganiifactor 1-alpha（tef1）保守區域內的特異性引物設計，通過基因庫BLAST 比對驗證引物的特異性。引物的合成委托上海生工有限公司完成。合成引物序列為：EF-S-1 5′-GCAAGAGTCGGATGGAAT-3′；EF-A-1 5′-TTGATTGACACTGTGCTAAC-3′，目的片段擴增大小為197bp。

1.5 特異性引物的驗證

1.5.1Calonectria屬通用引物的特異性驗證

用1.3中設計合成的引物CYS1／CYS2對參試菌株的基因組DNA 進行擴增，檢測其特異性。反應體系和反應程序同1.3。

1.5.2Calonectriamorganii特異性引物驗證

用合成的桉樹焦枯病菌（C.morganii）的特異引物EF-S-1／EF-A-1對參試菌株的基因組DNA 進行擴增，檢測其特異性，反應體系和反應程序同1.4。

1.5.3 雙重PCR 特異性引物驗證

利用Calonectri屬真菌特異性引物CYS1／CYS2和桉樹焦枯病原菌（C.morganii）的factor 1-alpha（tef1）基因的特異引物EF-S-1／EF-A-1 進行雙重PCR 擴增。PCR反應體系（50μL）：10×PCR buffer 5.0μL，MgCl23μL，10mmol／L dNTPs 1.5μL，CYS1（10mmol／μL）1.0μL，CYS2（10mmol／μL）1.0μL，EF-S-1（10mmol／μL）1.0μL，EF-A-1（10mmol／μL）1.0μL，Tag聚合酶（5 U／μL）0.3μL，ddH2O 32.2μL，基因組DNA 提取液4.0μL，組成反應混合液。PCR 反應條件為：94 ℃預變性5min；94 ℃變性40s，53 ℃退火35s，72 ℃延伸40s，共35 個循環；72 ℃延伸10min。

PCR 產物的電泳檢測：取5.0μL PCR 產物于含0.5μg／mL EB 的1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為9V／cm、時間為30min，在凝膠成像系統上檢測并拍照。

1.6 雙重PCR 靈敏度檢測

將桉樹焦枯病原菌（C.morganii）基因組DNA稀釋為450ng／μL、45ng／μL、4.5ng／μL、450pg／μL、45pg／μL、4.5pg／μL、450fg／μL、45fg／μL 濃度梯度，參照1.5.3 的反應體系和條件進行雙重PCR 靈敏度檢測。

1.7 田間時效檢測

2013年6-10 月，在重慶桉樹栽培園區內對不同發病程度的疑似桉樹焦枯病進行隨機采樣，根據實際感病情況對園區內桉樹焦枯病害的感病程度分級處理，共分為初期發病植株（0～25%）、中期發病植株（26%～50%）、嚴重發病植株（51%～75%）、具有典型癥狀植株（76%～100%）、健康植株（健康葉片）。按照發病組織DNA 提取方法提取DNA，照1.5.3 所述的方法進行雙重PCR 擴增，同時以加ddH2O 代替DNA 模板組和健康組做陰性對照。根據電泳檢測結果判定桉樹初期發病植株、中期發病植株、嚴重發病植株、具有典型癥狀植株、健康植株的樣品中是否攜帶C.morganii致病菌。

2 結果與分析

2.1 ITS區引物的特異性

利用真菌rDNA 基因ITS 區通用引物對所有供試菌株進行擴增，反應結果見圖1。結果顯示：供試的Calonectria屬全部菌株均可擴增出1 條351 bp大小的特異性明亮條帶，而對照組無條帶。通過片段回收測序及與已發表的Calonectria屬序列比對，其結果顯示同源率為100%，證明特異性引物CYS1／CYS2可以從混合DNA 樣中準確地檢測出Calonectria屬病菌，準確率為100%，可以有效地用于Calonectria屬菌株的檢測。

圖1 供試菌株經CYS1／CYS2特異性擴增結果Fig.1 The results of PCR amplification using specific primers CYS1／CYS2

2.2 factor 1-alpha（tef1）區引物的特異性

桉樹焦枯病病原菌（C.morganii）的特異性引物EF-S-1／EF-A-1對全部供試菌擴增反應結果見圖2。結果顯示：1～6泳道上的C.morganii均可擴增出1條197bp大小的特異性明亮條帶，而對照組無條帶。通過片段回收測序及與已發表的C.morganii的factor 1-alpha（tef1）基因序列比對，其結果顯示同源率為100%，證明特異性引物EF-S-1／EF-A-1可以從混合DNA 樣品中準確地檢測出桉樹焦枯病病原菌（C.morganii），準確率為100%。表明該引物用于桉樹焦枯病原菌（C.morganii）病害的PCR擴增檢測獲得成功。

2.3 雙重PCR 引物的特異性

雙重PCR 擴增反應結果見圖3。結果顯示：1～6泳道上的桉樹焦枯病菌均可擴增出2條明亮的特異性條帶，1條197bp，1 條351bp，而Calonectria屬的參試菌有且僅擴增出1條351bp大小的明亮條帶，而對照組無條帶。因此，特異性引物CYS1／CYS2和EF-S-1／EF-A-1 雙重PCR 可用于桉樹焦枯病原菌（C.morganii）病害的PCR 特異擴增。

圖2 供試菌株經EF-S-1／EF-A-1特異性擴增結果Fig.2 The results of PCR amplification using specific primers EF-S-1／EF-A-1

圖3 供試菌株經CYS1／CYS2和EF-S-1／EF-A-1雙重PCR 特異性擴增結果Fig.3 The results of duplex PCR amplification using specific primers CYS1／CYS2and EF-S-1／EF-A-1

2.4 雙重PCR 靈敏度檢測

利用引物CYS1／CYS2 和EF-S-1／EF-A-1 組合成雙引物擴增桉樹焦枯病原菌（C.morganii），其靈敏度測定結果（圖4）表明，雙重PCR具有較高檢測靈敏度，可達到450fg／μL，完全符合田間檢測的要求。

圖4 雙重PCR 靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity detection of duplex PCR

2.5 野外田間時效性檢測

利用雙重PCR 擴增桉樹初期發病植株、中期發病植株、嚴重發病植株、具有典型癥狀植株、健康植株的樣品DNA，經電泳檢測擴增結果表明：具有典型癥狀植株、嚴重發病植株、中期發病植株、初期發病植株均可以擴增得到分子量為197bp和351bp的2個片段，則可判定所測植株組織樣品中存在桉樹焦枯病原菌（C.morganii）（圖5），而部分初期發病植株樣品中沒有擴增到條帶，推測其所攜帶的目標病菌量未達到雙重PCR靈敏度檢測的極限。健康植株和陰性對照均沒有擴增出條帶，說明本試驗不存在污染，具有可靠性。

圖5 雙重PCR 引物檢測田間發病植株Fig.5 Detection of the filed diseased plant by using duplex PCR

3 結論與討論

桉樹焦枯病作為一種世界性病害，越來越多地受到人們的重視。加強病害的早期診斷是降低重大病害損失的有效手段。傳統病害的診斷方法主要以形態學及生理生化指標鑒定為主，該方法不僅費時費力、往往準確度較低，而且對鑒定者具有很高的專業知識要求，此外，肉眼鑒定病害的過程中會受到多種因素干擾，如分離培養的病原菌是否純化、培養條件的影響、生理指標的不穩定性等，因此基于傳統方法檢測病害在一定程度上存在弊端。PCR 及基于PCR 的快速診斷技術在林業病害上的應用彌補了傳統檢測的不足，同時，較高的準確性、精確性、時效性使得林業上多種重要病害的早期診斷成為可能，例如：松材線蟲病［13］、楊樹潰瘍病［14］、桉樹青枯病［15］等。目前，對于桉樹焦枯病的診斷仍停留在傳統形態學檢測上，因此建立桉樹焦枯病的快速檢測技術十分必要。

國內外大量學者研究證實，桉樹焦枯病是由多種真菌共同引起的病害，其中Calonectria屬的C.morganii是主要致病菌［16-17］。Crous 等［18-19］發現C.morganii、Cylindrocladiumclavatum（有性階段為Calonectria屬）、Calonectriacolhounii均是桉樹焦枯病的致病菌，區別在于其致病力的不同；在印度，侵染桉樹導致焦枯病的Calonectria屬真菌有十幾種，主要以C.quinqueseptata（無性階段為Cylindrocladiumquinqueseptatum）和C.morganii為代表；在阿根廷、巴西、印度、日本、新西蘭C.morganii是主要致病菌；在中國目前已發現的引起桉樹焦枯病的真菌也有十幾種，主要以C.morganii、C.ilicicola、C.quinqueseptata、Cylindrocladiumclavatum造成的危害較為嚴重，其中C.morganii和C.quinqueseptata為我國林業病害的檢疫對象［20］。前期研究發現，在四川、廣西、福建等地引起桉樹焦枯病的主要致病菌為C.morganii，因此，建立基于Calonectria屬真菌以及C.morganii病原菌的快速檢測對桉樹焦枯病的前期診斷十分必要。

雙重PCR 檢測是在常規PCR 檢測的基礎上發展而來的，它主要是以相同或不同的區域作為靶基因，進行兩對特異性引物的設計，以改善常規PCR靈敏度低和易發生非特異性的缺點［21］。隨著PCR檢測技術的不斷完善，相信雙重PCR 檢測技術在多種林木病害上的應用也將越來越普遍。同源性高的靶基因序列是檢測病害的前提保障，而特異性極強的保守序列是快速檢測單一種菌株體系構建成功的關鍵因子，Calonectria屬真菌在其ITS序列上同源性較高，可達到99%，C.morganii病原菌在factor 1-alpha基因上保守性極強，因此選擇兩者作為靶序列是試驗成功的理論基礎。本試驗基于C.morganii病原菌的ITS和factor 1-alpha基于序列，分別建立了Calonectria屬真菌和桉樹焦枯病菌（C.morganii）的特異性檢測體系，并進行了兩對引物共同體系的優化和建立，為以Calonectria屬真菌和C.morganii引起的桉樹焦枯病害早期診斷奠定了重要的理論依據，同時有關基于屬與種特異性不同而進行靶序列設計引物的雙重PCR檢測技術在國內屬于首次報道。

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