基于RNA-Seq識別山羊肉品質候選基因

孟憲然，杜 琛，王 靜，付紹印，鄭竹清，張文廣*，李金泉*

(1.內蒙古農業大學動物科學學院,動物遺傳育種與繁殖自治區重點實驗室，呼和浩特 010018； 2.內蒙古醫科大學附屬醫院 婦產科生殖醫學中心，呼和浩特 010050)

基于RNA-Seq識別山羊肉品質候選基因

孟憲然1#，杜 琛2#，王 靜1，付紹印1，鄭竹清1，張文廣1*，李金泉1*

(1.內蒙古農業大學動物科學學院,動物遺傳育種與繁殖自治區重點實驗室，呼和浩特 010018； 2.內蒙古醫科大學附屬醫院 婦產科生殖醫學中心，呼和浩特 010050)

通過研究不同年齡和不同性別絨山羊背最長肌之間的差異表達基因，篩選影響絨山羊肉品質的候選基因。本研究基于RNA-Seq技術對4個絨山羊背最長肌的轉錄組進行高通量測序，在測序評估的基礎上，對差異表達基因進行篩選、功能注釋和富集分析。本研究通過CLC Genomics Workbench 6.0軟件共找到263個候選基因，其中包含123個高表達有利基因和140個高表達有害基因。GO功能注釋結果顯示，高表達有利基因主要與骨骼肌的生長發育、細胞器的形成和蛋白結合功能有關；高表達有害基因主要與脂質代謝、細胞骨架以及結合功能有關。利用KEGG數據庫作為參考，這些基因主要參與糖酵解/糖異生、絲裂原活化蛋白激酶、凝血-補體級聯反應和色氨酸代謝等通路中。結合其他家畜基因組學研究，ADIPOQ、PDK4和CD36可能作為參與肉品質重要的候選基因。該結果為絨山羊肉品質的改善以及候選基因的研究提供了理論依據。

絨山羊；背最長肌；肉品質；RNA-Seq；候選基因

羊肉是人類飲食中主要的蛋白質來源之一，已被證實具有良好的營養價值，其肉質特性與現在消費者對營養肉的需求相一致，具有令人滿意的食用品質[1]。羊肉品質易受去勢、性別、年齡以及品種等多種因素影響。遠在殷商時代中國已有家畜去勢的記載，目的是消除家畜的性欲，使家畜的肉質得以改善、產量提高。去勢能夠增加肌內脂肪沉積，降低瘦肉率、屠宰率和剪切力值，提高肉的嫩度，同時能夠增加血液中FSH和LH水平，降低促性腺激素和雄激素睪酮濃度，減少肉的膻味，進而改善公畜肉品質[2-3]。鄭中朝等[4]對波雜肉羊的屠宰性能以及肉品質進行了研究，發現隨著年齡的增長，成年羊的屠宰性能優于羔羊，肌內脂肪含量增加，但成年羊肉的剪切力值較高，肉的嫩度變差；母羊的生長優勢顯著低于公羊，但成年母羊的肌內脂肪含量顯著高于成年公羊，剪切力值顯著降低，成年母羊肉的嫩度明顯優于成年公羊。王夢霖等[5]研究表明，隨著年齡的增長，周歲羊的產肉性能明顯優于羔羊，剪切力值和纖維直徑顯著增加，嫩度降低；母羊的屠宰性能顯著低于公羊，但隨著肌內脂肪沉積增加，肥肉率顯著高于公羊，肉的嫩度增加。由此可知，公羊肉因其肉質特性較差，膻味重等特點很難被消費者接受。

轉錄組是指特定組織或細胞在某一發育階段或功能狀態下轉錄出來的所有基因轉錄產物的總和，不僅包括mRNA，而且還包括非編碼RNA，是連接基因組遺傳信息與蛋白質組生物功能的橋梁[6-7]。轉錄組技術不僅能夠分析轉錄本結構和表達水平，同時也能發現未知轉錄本和稀有轉錄本，精確地識別可變剪切位點，提供更為全面的轉錄組信息[8-9]。近年來，隨著高通量測序技術的不斷發展，特別是RNA高通量測序技術的應用，使得轉錄組學研究得到了長足的進步，并應用于不同領域的多方位研究[10]。RNA高通量測序技術(RNA-Seq)，即利用大規模測序技術直接對cDNA序列進行測序，產生數以千萬計的reads，從而使得一段特殊的基因組區域的轉錄水平可以直接通過比對到該基因組區域的reads數來衡量[11]。目前主要應用于差異基因表達分析、功能基因挖掘、等位基因特異性表達、RNA剪接和融合基因轉錄子等相關研究中[12-13]。RNA-Seq對于真核生物的基因表達調控、癌癥治療和遺傳育種等方面的研究具有不可估量的潛力。隨著轉錄組技術的迅猛發展，已經得到人類和許多動植物的轉錄組信息，這為進一步研究生物的功能基因組學奠定了基礎。

目前關于山羊肉品質的研究還不像豬肉和牛肉等那樣廣泛且深入，利用轉錄組學技術研究山羊肉品質的報道更是少之又少。因此，本研究基于RNA-Seq技術在基因水平上對山羊背最長肌基因表達進行比較研究，以期篩選出與山羊肉品質相關的候選基因，從而為山羊肉品質的改善以及功能基因組學的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來自內蒙古白絨山羊種羊場。選取成年公羊、成年母羊、斷奶公羔和斷奶母羔的背最長肌為試驗樣品，采集后置于液氮中迅速冷凍，之后置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 背最長肌RNA提取、建庫及測序

按照Trizol法提取絨山羊背最長肌的總RNA，然后用無RNA酶(RNase)的DNA酶(DNase-I)處理去除總RNA中可能存在的痕量基因組DNA，最后再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，用核酸測定儀測定RNA濃度。以1 mg總RNA為起始量，參照Illumina建庫試劑盒進行cDNA文庫構建，具體操作見Truseq mRNA sample prep kit v2說明書。轉錄組測序工作由本實驗室完成。

1.3 轉錄組數據組裝及候選基因分析

利用CLC Genomics Workbench 6.0軟件對4個絨山羊背最長肌轉錄組的原始測序數據結果進行過濾和拼接組裝，篩選樣品間的差異表達基因，然后對各個差異表達基因進行注釋和功能分類。以人類基因組為參考，通過DAVID軟件對絨山羊肉品質的候選基因進行GO和KEGG功能富集分析。

2 結 果

2.1 絨山羊背最長肌轉錄組的組裝

獲得RNA-Seq的原始數據后去除其中低質量的數據，結果共獲得52 415 590個reads片段，其中成年公羊、成年母羊、斷奶公羔和斷奶母羔背最長肌轉錄組的reads數分別為12 807 070、12 927 794、13 825 310和12 855 416個，平均讀長為90 bp，共包含4 717 403 100個核苷酸序列信息，GC含量為49.4%。由此可以看出此次轉錄組測序的結果較好，可為后續的數據組裝提供較好的原始數據。利用DeNovo方法對52 415 590個reads進行拼接共獲得65 329個contigs，N50值為1 059 nt，其長度分布如圖1所示。然后將clean reads映射到contigs上，結果見表1。

圖1 絨山羊背最長肌轉錄組的contig長度分布Fig.1 Distribution of contig length for transcriptome of longissimus dorsi in cashmere goats

表1 絨山羊背最長肌轉錄組reads的Mapping統計結果

Table1 Reads mapping statistics of RNA-Seq oflongissimusdorsiin cashmere goats

樣本名稱Sample片段Reads比對上的Reads百分比/%PercentofReadsmapped核苷酸序列堿基數Nucleotides成年公羊(A)Adultrams(A)1280707091．011152636300成年母羊(B)Adultewes(B)1292779491．401163501460斷奶公羔(C)Malelambsweaned(C)1382531091．361244277900斷奶母羔(D)Femalelambsweaned(D)1285541690．331156987440合計Total524155904717403100

2.2 候選基因的篩選

首先篩選出絨山羊背最長肌4個轉錄組的差異表達基因，將所有差異表達基因取并集作為可能影響山羊肉品質性狀的候選基因。基因表達量的計算使用RPKM(Reads Per Kb per Million Reads)法,其計算公式：

其中，RPKM為特定生物樣品中某一基因的表達水平；R為匹配到該基因上的原始reads數目；N為該樣品測序得到的reads總數；L為該基因的長度(bp)。本研究利用CLCGenomicsWorkbench6.0軟件共找到474個成年公羊與成年母羊，成年公羊與斷奶公羔，成年母羊與斷奶母羔及斷奶公羔與斷奶母羔背最長肌間的差異表達基因(P<0.05,FDR<0.001 和FoldChange≥2)，其中成年公羊與成年母羊背最長肌間共201個，成年公羊與斷奶公羔背最長肌間共120個，成年母羊與斷奶母羔背最長肌間共100個，斷奶公羔與斷奶母羔背最長肌間共53個。取并集去重后共篩選到263個絨山羊肉品質候選基因，其中將成年公羊與另外3種羊基因表達量的比值大于2的基因定義為高表達有害基因，共計140個；表達量比值小于0.5的基因定義為高表達有利基因，共計123個，結果見表2。

表2 絨山羊肉品質候選基因

Table2 Candidate genes of meat quality in cashmere goats

分類Classification基因名Genesymbol有利基因BeneficialgenePDK4ADIPOQANKRD1ARID5BGPD1MBBuLA?DQBPGM1FLNCIGFBP?5GAPDHCSRNP1MIDNovar?MHCI?F9NFIL3DDIT4SLNMYBPC2RRADHSP70．1LOC101108462ID3ENO3KLF4PDLIM7JUNBDHRS7CLOC101398826Sdc4PGK1IFRD1NDUFB10ALDH2TUBB6LOC101009376JUNDFOSTPM4CD300LGDNAJA1HSPH1LOC101116336CD52ID1MAFFTMEM52KLF2DUSP1LOC100153946Cib2FOSBPER1GADD45GKLF10ABRALOC101388924EMP1CremTb24C26H8orf4THBDZFP36LOC101121285ASB5CST6MYL1BLA?DQBMYOM2GIGYF2LOC100430941HINT1IGF2RASD1PPP1R3CHSPA6RPS21LOC101364826DQA1CLIC4NR4A3Ovar?DRB1DRASPARCLOC100335469TMP1NR4A2ACTG1MACROD1CD74EGR1LOC101385063SRSF3UQCRHRCAN1TRYPTASE?1BTG2JUNLOC101107541TOB1METRNLIGFBP6C10H5orf13PMP22AK1LOC101108849DHDHALDOAAKAP12OMYHC2AXIRP1TIMP3LOC100851389HSPB8ROCK2CHCHD10C21H14orf2CNN1PAI?1LOC101106131USMG5GADL1BoLA?NCTNFRSF12A有害基因DeleteriousgeneCD36LPIN1ADIPOR2C1QCHRCC3EIF4EBP1NRAPCD63CASQ2MYOM3iglC1QBMAP1LC3BDESNFICIMPA2PSAP089IGKCSRP3Iggamma?1PFN2PRM1HSPB2FBXO32IDO1PSMD4METTL21CCOX1USP13RNF115ACADMCUTCSTAT5BVlambda1bACY1Hspb6LMOD3RBM38ASB2SCPEP1TMEM120ASBDSSYNPOSORT1SESN1SELKSEPP1C25H10orf71EIF5DDIT4LSMTNL1TWF2ATGLAMPD3LOC787392CSDAMYBPHFCER1GWIPI1SMPXTTNLOC781267DOK5THBS4UNC45BPPDPFOVARSHISA5LOC101424NOL3EIF2S3PACSIN3LIMS1FTH1EGLN3LOC101112287UGP2REEP5ANKRD2ARRDC2YPEL3IFITM1LOC100157000COX3WARSSERINC2SCHIP1TACC2MYOZ2LOC101798204OPTNTHOP1PSMD13MYL6BEGLN1BNIP3LOC101105397CST3TIAF1SMTNL2HSPB1GLRXCTSSLOC100153853C1QAASB11MUSTN1LMOD2PCBD1SAP1LOC100685697YBX3PALMDTMEM159PM20D2ACTR1BTXLNBLOC100101238APODSYNPO2SYNPO2LSLC29A2CXCL12HADHALOC101121454GMPRSTAT5AQUAKINGHOMER2MLLT11MAPRE2LOC101119652FHL1SYNGR2SLC43A2CDKN1APDLIM3GATSL2LOC101111776

2.3 候選基因的GO功能分類

GO(Gene Ontology)是一個國際標準化的基因功能分類體系，將基因按照其參與的生物學過程、細胞組分和分子功能3個角度進行分類，進而對基因進行限定和描述。本研究利用David軟件中的“GO Functional Annotation Chart”模塊分別對高表達有利基因和高表達有害基因進行GO功能分類，篩選P<0.05的通路并統計每一類基因的數量，結果如圖2所示。在生物學過程中，高表達有利基因主要與發育相關，主要參與骨骼肌的生長發育過程。已有研究顯示，ADIPOQ(脂聯素)能夠加快畜禽肌肉組織中葡萄糖的轉運、游離脂肪酸的β氧化和改善胰島素抗性等生物學作用，其主要是通過活化AMP激活的蛋白激酶(AMPK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑激活β氧化和氧化磷酸化過程中相關基因的表達來實現的[14-16]。另外，脂聯素受體能夠通過調控CD36的表達影響脂肪酸的跨膜轉運。高表達有害基因主要與調控和脂質代謝相關。在細胞組成分中，高表達有利基因主要參與細胞器的形成；高表達有害基因主要與細胞骨架相關。在分子功能中，高表達有利基因和高表達有害基因主要與結合功能相關。

a.高表達有利基因；b.高表達有害基因a.Highly expressed beneficial genes； b.Highly expressed deleterious genes圖2 高表達有利和有害基因GO功能分類Fig.2 Gene Ontology of highly expressed beneficial and deleterious genes

2.4 候選基因的KEGG代謝通路富集分析

在生物體內，不同基因相互協調行使其生物學功能，根據KEGG的分析有助于進一步分析差異表達基因中存在的顯著性富集的代謝通路注釋。本研究使用David軟件中的“KEGG Functional Annotation Chart”模塊分別對高表達有利基因和高表達有害基因進行KEGG通路富集分析，結果共得到10條通路，其中顯著富集的通路有7條，主要參與到糖酵解/糖異生、絲裂原活化蛋白激酶、凝血-補體級聯反應、朊病毒病、ErbB受體、色氨酸代謝和系統性紅斑狼瘡等通路中(表3)。糖酵解/糖異生過程對于維持動物機體的能量代謝平衡和骨骼肌的發育有重要的影響，其中PDK4(丙酮酸脫氫酶激酶4)在這一過程中起著重要的作用。有研究表明，PDK4對于脂肪沉積有促進作用，其主要是通過抑制自身的活性激活PDC(丙酮酸脫氫酶復合體)進而增加葡萄糖向脂肪酸轉化來實現。

3 討 論

本研究通過RNA-Seq方法共篩選到263個對絨山羊肉品質有影響的候選基因，其中包含123個高表達有利基因和140個高表達有害基因。其中高表達有利基因PDK4(丙酮酸脫氫酶激酶4)是PDK/BCKDK蛋白激酶家族成員之一，在調節骨骼肌糖代謝與脂肪酸轉換的過程中發揮重要的調控作用，與動物骨骼肌的生長發育密切相關。N.De Jager[17]對牛骨骼肌的基因表達進行研究，發現西澳大利亞牛骨骼肌中的PDK4表達量遠高于新南威爾士牛，并且西澳大利亞牛骨骼肌的大理石紋等級優于新南威爾士牛，這表明PDK4表達量越高，肌內脂肪沉積越多，肉品質越好。本研究發現，隨著年齡的增長，母羊骨骼肌中的PDK4表達量隨之升高，而公羊骨骼肌的PDK4表達量隨之降低，結果會導致母羊骨骼肌中沉積的脂肪含量高于公羊，這與王夢霖等[5]研究結果一致。因此，PDK4可作為影響絨山羊肉品質的一個重要候選基因，但需要進一步深入研究。

表3 高表達有利基因和有害基因KEGG代謝途徑分類

Table3 KEGG classification of highly expressed beneficial and deleterious genes

分類Classification通路Pathway基因數GenenumberP值P?value通路IDPathwayID有利基因BeneficialgenesGlycolysis/Gluconeogenesis64．13E?05hsa00010MAPKsignalingpathway77．68E?03hsa04010有害基因DeleteriousgenesComplementandcoagulationcascades41．88E?02hsa04610Priondiseases33．34E?02hsa05020ErbBsignalingpathway43．44E?02hsa04012Tryptophanmetabolism34．26E?02hsa00380Systemiclupuserythematosus44．76E?02hsa05322

ADIPOQ是脂肪細胞特異性分泌的一種細胞因子，在骨骼肌和脂肪組織中調控生物體的糖代謝、脂肪酸代謝和能量平衡，是迄今為止所發現的惟一與肥胖呈負相關的脂肪細胞特異性蛋白，屬于2型糖尿病保護因子，具有增加胰島素敏感性、抗糖尿病和抗動脈粥樣硬化等作用。目前人們對小鼠、人、豬、雞、牛和山羊的ADIPOQ基因都有研究，但主要集中在豬、家禽和牛等動物的基因和其受體的克隆以及基因多態性分析等方面[18]。戴麗荷等[19]對大白豬、長白豬和梅山豬脂聯素基因內含子進行突變檢測，發現內含子2中985位的A/G發生突變，在其F2資源家系群體中進行性狀關聯分析表明，A等位基因有利于增加眼肌面積和瘦肉率，減少背膘厚，同時降低了肌內脂肪含量，肌肉口感變差，最終影響了肉品質。值得注意的是，脂聯素是通過調控受體AdipoR1和AdipoR2發揮其重要的生理作用。AdipoR1主要在骨骼肌中表達并介導激活AMPK信號通路；而AdipoR2主要在肝和脂肪組織中表達并介導激活PPARα信號通路，通過誘導FATP(脂肪酸轉運蛋白)和CD36(脂肪酸轉位酶)的表達進而促進脂肪酸的跨膜轉運[20-21]。由此可見，脂聯素及其受體對畜禽肉品質具有重要影響。

CD36是參與脂肪酸跨膜轉運和脂肪沉積的重要載體蛋白，在脂肪細胞和骨骼肌細胞中參與脂肪酸的運輸[22]。束剛等[23]對黃羽肉雞進行CD36重組融合蛋白免疫，發現首次免疫15 d后便產生較高的抗體效價，而且特異性地抑制公雞腹脂的沉積水平，說明體內抗CD36抗體能夠有效地中和內源性脂肪細胞膜CD36，通過部分阻斷轉運脂肪酸的功能，從而降低肌內脂肪的沉積。L.Love-Gregory等[24]研究表明，CD36可以促進血漿中游離脂肪酸的吸收，在脂肪組織中參與脂肪酸的貯存。但血漿中高濃度的脂肪酸會產生炎癥性反應而影響胰島素信號使機體產生胰島素抗性，進而導致機體糖代謝減少，脂肪代謝增加，最終導致脂肪沉積減少。因此，CD36可以作為肉品質研究的一個重要候選基因。

在生物體內，各生物學功能的完成都是基于各個基因間系統地相互協調而進行的，通過對基因進行KEGG通路富集分析，可以更深入地了解該基因的生物學功能以及與其他基因間的相互作用。KEGG通路數據庫儲存了基因功能的相關信息，通過圖形來表示細胞內的生物學過程，例如代謝、膜運輸、信號轉導和細胞的生長周期等[25]。本研究中高表達有利基因主要參與到糖酵解/糖異生和絲裂原活化蛋白激酶信號通路中，其中糖酵解/糖異生過程不僅與骨骼肌的生長發育和動物機體能量代謝平衡的維持相關，而且與肌內脂肪沉積相關，這一結果可以為肉品質的研究提供一種全新的視角和理論依據。

4 結 論

本研究利用Illumina Miseq高通量測序平臺對絨山羊背最長肌的4個轉錄組進行測序后，結果共獲得52 415 590個reads片段，包含了4 717 403 100個核苷酸序列信息，利用DeNovo方法對reads片段進行拼接，共得到65 329個contigs，N50值為1 059 nt。利用CLC Genomics Workbench 6.0軟件共篩選到263個與山羊肉品質相關的候選基因，其中包含123個高表達有利基因和140個高表達有害基因。通過David軟件分別對高表達有利基因和有害基因進行GO功能注釋和KEGG富集分析發現，糖酵解/糖異生過程對于維持動物機體的能量代謝平衡和骨骼肌的生長發育有重要的影響，并且與肌內脂肪沉積相關。結合其他家畜基因組學研究，ADIPOQ、PDK4和CD36可能作為參與肉品質重要的候選基因。高通量RNA-Seq提供了更為全面的山羊背最長肌全轉錄組信息，為山羊肉品質的改善及功能基因組研究提供了基礎數據和參考。

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(編輯 郭云雁)

RNA-Seq Approach for Identifying Candidate Genes of Meat Quality in Goats

MENG Xian-ran1#，DU Chen2#，WANG Jing1，FU Shao-yin1，ZHENG Zhu-qing1， ZHANG Wen-guang1*，LI Jin-quan1*

(1.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductionofInnerMongoliaAutonomousRegion，CollegeofAnimalScience，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China；2.DepartmentofObstetricsandGynecology，AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010050，China)

To screen candidate genes which effect on meat quality of cashmere goats，we explored differentially expressed genes oflongissimusdorsiin cashmere goats with different ages and genders.The high-throughput sequencing for transcriptome oflongissimusdorsiin cashmere goats was performed by RNA-Seq.Differentially expressed genes were selected as candidates genes and enriched based on GO and KEGG database after quality control of RNA-Seq.The 263 candidate genes including 123 beneficial and 140 deleterious genes were selected by CLC Genomics Workbench 6.0 software.The results of GO enrichment showed that the highly expressed beneficial genes were primarily related to growth and development of skeletal muscle，organelle formation and protein binding.The highly expressed deleterious genes were primarily related to lipid metabolic process，cytoskeleton and binding.According to the KEGG database，these genes were mainly involved in glycolysis/gluconeogenesis’mitogen-activated protein kinase，complement and coagulation cascades and tryptophan metabolism.As example，ADIPOQ，PDK4 andCD36 might be important candidate genes involved in meat quality，when combining with other livestock genomics study.These results provided theoretical basis for improving meat quality and studying candidate genes in cashmere goats.

cashmere goat；longissimusdorsi；meat quality； RNA-Seq；candidate gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.004

2014-11-10

國家自然科學基金(30960246)；內蒙古自然科學基金(2010Zd11)；“內蒙古自治區草原英才”與“內蒙古自治區高等學校創新團隊發展計劃”(NMGIRT1106)；國家絨毛用羊現代農業產業技術體系(CARS-40-05)

孟憲然(1988-)，男，河北承德人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：mxr1103@126.com；杜 琛(1986-)，女，博士， E-mail：duchen198607@126.com。 孟憲然和杜琛同為第一作者

*通信作者：張文廣，E-mail：actgnmbi@aliyun.com.cn；李金泉，E-mail:lijinquan_nd@126.com

S827.2

A

0366-6964(2015)08-1300-08