基于GC-MS策略的奶牛熱應激血液代謝組學研究

郭延生,賈啟鵬,陶金忠

(寧夏大學農學院 動物科學系，銀川 730020)

基于GC-MS策略的奶牛熱應激血液代謝組學研究

郭延生,賈啟鵬,陶金忠*

(寧夏大學農學院 動物科學系，銀川 730020)

為了系統揭示熱應激對奶牛血液代謝物及其代謝通路的影響。本研究根據奶牛熱應激的判定標準，選擇10頭處于熱應激狀態的荷斯坦高產泌乳牛為熱應激組，至次日凌晨直腸溫度和呼吸頻率恢復到正常范圍時，再次被視為恢復組。各組奶牛尾靜脈采血，制備血漿。然后采用GC-MS代謝組學技術，結合模式識別策略尋找兩組奶牛血液差異代謝物，并將差異代謝物輸入KEGG數據庫進行代謝通路的構建與功能分析。結果表明，8個內源性代謝物可作為奶牛熱應激的潛在生物標志物。其中，葡萄糖、α-亞麻酸、亞油酸、甘油、棕櫚酸、β-羥丁酸和甘氨膽酸鹽含量在熱應激過程中顯著降低，而乳酸含量顯著升高。提示熱應激加劇了奶牛能量負平衡狀態，主要通過增強脂肪酸氧化和甘油分解代謝途徑活性，抑制糖酵解過程進行調節和應答，在此過程中伴有肝功能障礙的生理現象。研究結果可為進一步闡明奶牛熱應激的生理機制提供科學依據。

熱應激；奶牛；代謝組學；GC-MS；血液代謝物

奶牛熱應激是指奶牛受到超過本身體溫調節能力的過高溫度刺激時,引起機體發生的一系列異常反應。為了適應熱應激，奶牛開始動用物理、生化和生理過程進行調節，以維持熱平衡和正常體溫。高產泌乳牛處于能量負平衡狀態，而熱應激時奶牛為了降低體內代謝熱，本能的減少干物質采食量[1-2]，進一步加劇了高產泌乳牛的能量負平衡[3]。大量研究表明，熱應激時奶牛產奶量和繁殖性能顯著降低與其血液代謝物變化和能量負平衡密切相關[4-9]。因此檢測血液內源性小分子物質代謝輪廓的變化有助于進一步揭示熱應激引起奶牛泌乳性能和繁殖性能下降的生理機制。但目前研究僅局限于對血液中某些有限的生理指標的檢測，并且這些生理指標來自不同的試驗和報道，缺乏整體系統的檢測方法研究熱應激奶牛血液生理指標的代謝輪廓。代謝組學技術已應用于多種疾病生物標志物的挖掘和篩選中，它以生物體內小分子物質的動態規律變化來表征生物體的生理病理變化趨勢，最終通過還原相關聯生物事件提示生物體的病理生理變化實質和機制所在，其高通量的特性可以使體內同時出現的多個生理指標相互關聯起來。

本研究采用GC-MS代謝組學技術，結合模式識別方法研究熱應激對泌乳奶牛血液內源性代謝物的變化，以進一步闡明奶牛熱應激的生理機制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

美國安捷倫 6890N/5973N型GC-MS氣質聯用儀，梅特勒AL104電子分析天平，美國BECKMAN 公司OPTIME L-80 低溫高速離心機 。

吡啶、乙腈、二十二烷、正庚烷等均為分析純(北京北化康泰臨床試劑有限公司)；甲氧胺鹽酸鹽、N-甲基-三甲基硅烷-三氟乙酰胺(MSTFA)：三甲基-氯硅烷(TMCS) =100∶1(瑞士 Fluka公司)。

1.2 試驗動物和樣品采集

試驗奶牛來自寧夏某私人養殖場，在當地氣候最炎熱的月份(8月)，連續檢測該場的圈舍溫度和濕度，以濕溫指數作為評價該場奶牛是否出現熱應激的條件。根據奶牛熱應激的判定標準，當圈舍濕度指數大于72時，奶牛處于熱應激狀態。據此標準10頭2～3胎，泌乳60～90 d的荷斯坦高產泌乳母牛被選為熱應激組，檢查試驗牛直腸溫度均高于39 ℃，呼吸頻率在90～120 次·min-1。用含肝素的采血管于尾靜脈采血，3 000 r·min-1，4 ℃離心分離10 min制備血漿，編號1～10，于-80 ℃冰箱保存。次日06：00上述奶牛直腸溫度和呼吸頻率恢復到正常范圍，被再次視為恢復組采集血樣，用同樣方法制備血漿并保存，編號11～20。

1.3 血漿樣品的衍生化

將血漿樣品從-80 ℃取出，在室溫條件下解凍，取其解凍后的樣品100 μL放入離心管中，加入乙腈250 μL以除去蛋白；在冰浴冷卻的條件下超聲10 min，4 ℃離心機中以10 000 r·min-1離心分離10 min，離心后的樣品取其上清液于1.5 mL離心管中；將上清液放入40 ℃條件下的真空干燥箱中使其揮發至干；取出干燥的離心管，加入15 mg·mL-1甲氧胺吡啶溶液50 μL使其充分混勻，再在70 ℃條件下肟化1 h，加入MSTFA：TMCS=100∶1硅烷化試劑50 μL，進行衍生化處理，充分混勻后靜置1 h，而后加入含有二十二烷的正庚烷(內標，0.1 mg·mL-1)150 μL，使其充分混勻，于4 ℃ 10 000 r·min-1離心10 min[10]，然后移取全部上清液于微量進樣管中，以備GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析

GC-MS分析條件：進樣量1 μL，初始溫度為85 ℃，保持5 min，程序升溫以10 ℃·min-1的速度上升至280 ℃，保持10 min；進樣口溫度：270 ℃；接口溫度：270 ℃；離子源(EI)溫度：230 ℃；電離電壓：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；載氣(高純氦氣)：流速1.0 mL·min-1；掃描方式：全掃描60～600 m·z-1。色譜柱：OV-1701[11]。

1.5 代謝組學數據分析

從Aglient 6890N/5973N 型GC-MS氣質聯用儀 Chemstation 采集的信號和質譜數據以ASCII的文件的格式(*.csv)輸出，導出的原始數據采用Matlab7.0軟件對每一個峰進行校準并積分，積分后峰匹配后得到峰表，峰表由化學成分的保留時間和相應的峰面積組成。用內標法計算不同組樣品的峰組成的相對含量。得到變量的峰表。此峰表包括了一些缺失值，根據S.Bijlsma等[12]報道的缺失值處理方法，采用修正80%的原則來去除缺失值，即去除某一組中出現頻率低于80%的代謝物，得到一個由代謝物的相對峰面積和保留時間組成的二維數據矩陣。此矩陣被導入SIMCA-P 12.0軟件(瑞典Umetrics AB公司)中的主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法判別分析法(PLS-DA)進行模式識別分析，篩選差異代謝物，作為奶牛熱應激的潛在生物標志物。

1.6 生物標志物的鑒定及代謝通路分析

根據生物標志物的質譜碎片(RI)，主要通過比較儀器自帶的美國國家標準與技術局化學數據庫(National Institute of Standards and Technology，NIST)圖書館物中的質譜信息，進行生物標志物的鑒定和推測。如果質譜碎片在NIST圖書館中不匹配，再將RI與 Metabolome Database (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/gmd.html)和Metabolome 數據庫(http://www.hmdb.ca/) 進行比較，最終確定其結構。為進一步識別和可視化熱應激對奶牛血液代謝途徑的影響，將鑒定后的生物標志物輸入KEGG數據庫(http://www.kegg.com)，選擇Bostaurus(cow通路)為通路路徑庫，進行代謝通路的構建與分析。

2 結 果

2.1 奶牛血液代謝物的GC-MS分析

按1.4方法建立了熱應激奶牛血液GC-MS指紋圖譜，其總離子流圖見圖1。導出的原始數據采用Matlab7.0軟件進行數據預處理后得到一個20樣本×95變量的峰表，此表是由相對峰面積和保留時間組成的二位數據矩陣。

1～20.血漿編號：1～10.熱應激組；11～20.恢復組1-20.The plasm sample code：1-10.Heat stress dairy cows；11-20.Recovery dairy cows圖1 奶牛血漿GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current (TIC) chromatograms for the GC-MS metabonomic analysis in dairy cows plasma

2.2 模式識別和差異代謝物的篩選

將所得二位數據矩陣導入SIMCA-P 12.0軟件進行模式識別，首先采用非監督類的模式識別方法PCA對奶牛血液 GC-MS代謝指紋峰的內在相似性進行識別，在PCA得分圖中，每個點代表一個獨立的樣品。從圖2A可以看出，血液樣品7和10位于95%置信區間外，從數據矩陣中發現這兩個樣品的內標峰面積極顯著低于其他樣品的峰面積，推測可能由于樣品衍生化過程中的試驗誤差所致。過低的內標峰面積會影響相對峰面積的值。因此樣品7和10被排除后進一步進行PCA分析，新的PCA散點圖(圖2B)顯示剩余的18個樣品均在95%置信區間。

在PCA模型基礎上，采用PLS-DA模型進一步分析熱應激對奶牛血液代謝模式的影響，繼而篩選差異代謝物。從PLS-DA模型3D得分散點圖(圖3)可以看出，根據相對峰面積，熱應激組與恢復組被明顯區分開，18個樣品均在95%的置信區間。PLS-DA載荷圖代表了變量對分類的影響，距中心越遠，表明變量具有更高的VIP值(Variable importance in the projection)，VIP值大于1.0的變量被視為對分類具有重要意義的變量。根據變量載荷圖和VIP值(圖4)，VIP值大于1.0的8個代謝物被選為奶牛熱應激的差異代謝物或潛在生物標志物(表1)。

A.20個樣品；B.18個樣品A.The PCA model of 20 samples；B.The PCA model of 18 samples圖2 奶牛血漿PCA 得分散點圖Fig.2 PCA score plots of dairy cows plasma

圖3 奶牛血漿PLS-DA 3D得分散點圖Fig.3 PLS-DA 3D score plots of dairy cow plasma

2.3 生物標志物的鑒定和代謝通路分析

根據NIST，8個奶牛熱應激生物標志物的結構被確認(表1)，各生物標志物衍生化后的質譜碎片(RI)見圖5所示。其中恢復組葡萄糖、α-亞麻酸、亞油酸、甘油、棕櫚酸、β-羥丁酸和甘氨膽酸鹽含量較熱應激組明顯降低(P<0.05)，而乳酸含量明顯升高(P<0.01)(表1)。為了進一步解釋熱應激對奶牛生理機制的影響，8個生物標志物被輸入KEGG數據庫進行了代謝通路分析，結果顯示，熱應激過程中，糖酵解途徑被抑制，而能量代謝、脂肪酸氧化、甘油分解代謝增強，并且伴有肝功能障礙的生理現象。

3 討 論

泌乳牛處于能量負平衡的生理狀態，據報道，熱應激時奶牛能量消耗增加，血糖濃度降低[13-14]。本研究采用GC-MS代謝組學技術也證實恢復組奶牛血糖濃度低于熱應激組，即奶牛在應激過程中血糖濃度呈降低趨勢，說明葡萄糖氧化途徑活性增強，以提供更多的能量彌補熱應激所致的能量過度消耗。這在一定程度上加劇了奶牛能量負平衡狀態。

研究結果進一步表明，恢復組α-亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸和β-羥丁酸的含量低于熱應激組，這與L.Calamari等的報道相一致[14]，說明應激奶牛自身通過增強脂肪酸β-氧化活性，釋放更多的能量來彌補應激所致的能量過度消耗。已知甘油代謝與糖代謝關系十分密切，血中的甘油被運送至肝組織，主要在甘油激酶的催化下轉變成3-磷酸甘油，然后脫氫生成磷酸二羥丙酮，后者循糖的分解途徑進一步代謝或者進入糖的異生途徑轉變為葡萄糖或糖原。本研究結果顯示，恢復組奶牛血液中甘油的含量低于應激組，說明熱應激時甘油分解代謝途徑活性增強，這同樣有利于彌補應激所致的能量不足。

目前尚無熱應激時奶牛血中乳酸含量變化的相關報道。本研究采用GC-MS代謝組學技術發現，應激組奶牛血中乳酸含量低于恢復組，表明在應激過程中糖酵解途徑的活性被抑制，這與應激時脂肪酸β-氧化活性增強可相互印證，因為早期的研究已經證實，脂肪酸β-氧化活性增強，細胞中檸檬酸的濃度升高，檸檬酸可通過抑制磷酸果糖激酶以減慢糖酵解途徑的活性過程。另據報道，熱應激時由于碳酸氫鹽的變化致使奶牛血液pH呈現從堿中毒到酸中毒的晝夜節律性變化，并且在氣溫涼爽的晚上表現出代謝性酸中毒的狀態[15]。本研究中熱應激時乳酸含量的變化也呈現出這種晝夜規律性的變化趨勢。乳酸因其強酸性對血液pH也有較大的影響，因此推測，熱應激時奶牛血液pH晝夜節律性變化不僅與過度呼吸所致的碳酸氫鹽的濃度有關，同時也與乳酸含量變化有關。

表1 熱應激組與恢復組生物標志物含量比較(平均值±SD)

Tables 1 Comparison of biomarker contents between heat stress and recovery cows (mean±SD)

代謝物Metabolite保留時間/minRetentiontimeVIP值VIPvalue熱應激組(n=8)Heatstressgroup恢復組(n=10)Recoverygroupα?亞麻酸Alpha?Linolenicacid18．062．210．088±0．0180．059±0．026?亞油酸Linoleicacid23．711．640．009±0．0070．005±0．003?乳酸Lactate12．481．502．465±0．6898．889±0．558??D?葡萄糖D?glucose24．081．380．193±0．0550．151±0．084?甘油Glycerol15．511．150．732±0．1850．673±0．208?棕櫚酸Hexadecanoicacid28．011．090．401±0．1950．337±0．193?甘氨膽酸鹽Glycocholate21．901．480．009±0．0030．007±0．003?β?羥丁酸β?Hydroxybutanoate14．981．300．017±0．0130．009±0．005??

Compared with heat stress cows：*.P<0.05，**.P<0.01

圖4 奶牛血漿PLS-DA載荷圖(A)和VIP(B)Fig.4 Loading plot (A) and VIP plot (B) of PLS-DA for dairy cow plasma

A.α-亞麻酸；B.亞油酸；C.乳酸；D.D-葡萄糖；E.甘油；F.棕櫚酸；G.甘氨膽酸鹽；H.β-羥丁酸A.Alpha-Linolenic acid；B.Linoleic acid；C.Lactate；D.D-glucose；E.Glycerol；F.Hexadecanoic acid；G.Glycocholate；H.β-Hydroxybutanoate圖5 熱應激生物標志物衍生物的GC-MS質譜圖Fig.5 Mass spectra of derivative of heat stress biomakers

眾所周知，膽汁酸在肝中由膽固醇轉化生成，然后排入腸腔，大約95%的膽汁酸被重吸收后經門靜脈返回肝，僅有少部分進入血液循環。因此血液膽汁酸的濃度高低取決于肝功能的狀態，當肝損傷時血中膽汁酸濃度極易升高。甘氨膽酸鹽是膽汁酸的主要成分，因此血中甘氨膽酸鹽是目前公認的反映肝損傷的最敏感指標。本研究結果顯示，熱應激組奶牛血中甘氨膽酸鹽的含量高于恢復組奶牛，說明熱應激有可能引起肝功能障礙，盡管在本試驗中甘氨膽酸鹽的升高僅僅是生理性升高。據報道，熱應激可導致奶?？寡趸芰ο陆礫16-18]，因此可以推測甘氨膽酸鹽含量升高可能與熱應激時抗氧化能力下降，肝組織脂質過氧化有關。

4 結 論

本研究采用GC-MS代謝組學方法研究了熱應激對奶牛血液內源性小分子物質代謝的影響，8個代謝物被確定為熱應激潛在的生物標志物，結構鑒定確認為葡萄糖、α-亞麻酸、亞油酸、甘油、棕櫚酸、β-羥丁酸、甘氨膽酸鹽和乳酸。代謝通路分析顯示，熱應激加劇了泌乳牛能量負平衡的狀態，主要通過增強脂肪酸氧化和甘油分解代謝途徑的活性，抑制糖酵解過程來緩解應激時能量負平衡的生理狀態，在此過程中伴有肝功能障礙的生理現象。研究結果對進一步闡明奶牛熱應激的生理機制具有重要的科學意義。

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(編輯 郭云雁)

Blood Metabolomic Studies of Heat Stress Cow with GC-MS

GUO Yan-sheng，JIA Qi-peng，TAO Jin-zhong*

(DepartmentofAnimalScience，SchoolofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan730020，China)

The study aimed to reveal the effects of heat stress on dairy cow blood metabolites and its metabolic pathways in a systematic way.According to the criteria for evaluating cow heat stress，10 high milk yield Holstein cows in heat stress status were selected as heat stress group，these cows were regarded as recovery group again until their rectal temperature and respiratory rate returned to the normal range at next morning.Blood samples of each group were collected via tail vein and the plasm were separated.And then we developed and applied a gas chromatography-mass spectrometry GC-MS metabolomics protocol combined with pattern recognition approaches to search differential metabolites between the heat stress and recovery groups，and the differential metabolites were analyzed by KEGG for reconstructing the metabolic pathway and functional analysis.8 metabolites were selected as heat stress potential biomakers and indentified.These biomarkers included alpha-linolenic acid，linoleic acid，lactate，D-glucose，glycerol，hexadecanoic acid，glycocholate and β-Hydroxybutanoate.The content of lactate in heat stress status increased，the other metabolites decreased.Functional pathway analysis revealed that heat stress aggravated the state of energy negative balance in cow，and the lactating dairy cow blood metabolically responded to heat stress through increasing β-oxidation of fatty acid and glycerol metabolic and decreasing in glycolosis activity accompanied with liver dysfuction.The study may provide a strong evidence for further researching the physiological mechanism of heat stress cow.

heat stress；dariy cows；metabonomics；GC-MS；blood metabolites

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.011

2014-11-12

寧夏自然科學基金(NZ12151)

郭延生(1978-)，男，甘肅莊浪人，博士，副教授，主要從事臨床獸醫學研究，E-mail：guoyansheng1978@163.com

*通信作者：陶金忠，副教授，E-mail:tao_jz@nxu.edu.cn

S815.4

A

0366-6964(2015)08-1356-07