早期胚胎血管顯微注射慢病毒載體制備轉基因禽類的研究

張自富，趙 瑜，劉錦妮，李 洵，彭新亮，章 平，胡 靜，賀東陽，常姣姣，谷夢迪，金楠楠，王亞芳

(信陽農林學院動物科學系 生物技術與動物繁殖實驗室，信陽 464000)

早期胚胎血管顯微注射慢病毒載體制備轉基因禽類的研究

張自富*，趙 瑜，劉錦妮，李 洵，彭新亮，章 平，胡 靜，賀東陽，常姣姣，谷夢迪，金楠楠，王亞芳

(信陽農林學院動物科學系 生物技術與動物繁殖實驗室，信陽 464000)

根據禽類獨特的生殖生理特點及特殊的胚胎發育模式，把原始生殖細胞法、顯微注射法和慢病毒載體法3種轉基因技術結合起來，以期探索出簡便、高效的生產轉基因禽類新方法。在鵪鶉胚胎發育至第13～15期，血液循環中的原始生殖細胞(Primordial germ cells，PGCs)數目達到最高值，血管顯微注射攜帶增強型綠色熒光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein，eGFP)的人類免疫缺陷病毒I型(Human immunodeficiency virus-1，HIV-1)慢病毒載體，每枚胚胎注入1 μL，滴度為1×109TU·mL-1。80枚鵪鶉種蛋，孵化出雛48只，孵化率為60%；對新生鵪鶉解剖后，在熒光顯微鏡下檢測，其喙部、羽毛、眼部、大腦、血管、心、肝、脾、肺、腎、腺胃、腸系膜、小腸、大腸、輸卵管、肌肉及爪上檢測到綠色熒光蛋白表達，特別是在性腺中觀察到綠色熒光蛋白廣泛性表達。G0代28只雄性鵪鶉中，成功采集到21只精液，其中5只個體精子基因組經聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)檢測陽性，陽性率為23.8%(5/21)；在5只陽性個體的G1代46只后代中，有6只經PCR及印跡雜交(Southern blot)檢測均為陽性，陽性率為13.0%(6/46)。利用胚胎發育至第13～15期血管顯微注射慢病毒載體能夠有效感染此時期遷移的PGCs，獲得性系嵌合體個體，最終成功獲得轉基因后代。該方法簡便、高效的生產出轉基因禽類，必將為禽類轉基因研究提供一種新的思路和方法。

顯微注射；慢病毒載體；轉基因禽類；增強型綠色熒光蛋白

禽類獨特的生殖生理特點以及禽類胚胎的體外發育方式與哺乳動物有很大不同，禽類受精卵產出體外時已發育到囊胚期，傳統的哺乳動物轉基因方法不適合在家禽中應用。慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉錄病毒科(Retrovidae)，不僅具有逆轉錄病毒的基本特性，還具有廣泛感染各種非分裂期細胞的特性，克服了逆轉錄病毒表達易沉默的缺陷，可以整合到宿主細胞的基因組上長期穩定表達，宿主免疫反應小等優點[1-4]。應用慢病毒載體介導對禽類胚胎的遺傳操作，無疑具有極大的優勢。將包裝好的病毒顆粒導入禽類胚胎，使其感染原始生殖細胞或生殖干細胞，通過病毒感染將目的基因整合到其基因組中，孵出后獲得性系嵌合體，再將這些嵌合體家禽與同種野生型個體交配，在子代中就可能獲得攜帶有外源基因的轉基因個體，慢病毒載體法已成為制備轉基因禽類最有效和最成功的方法之一[5]。

目前報道的利用慢病毒載體介導制備轉基因禽類都是將慢病毒載體注射到發育第Ⅹ期的胚盤下腔中，通過感染胚盤中的原始生殖細胞制備轉基因禽類[6-15]。這種方法一般要通過3期培養體系對雞胚胎進行孵化[7]，過程繁瑣，往往導致胚胎孵化率較低。為了獲得更多的個體不僅需要包被大量的高滴度慢病毒顆粒，而且由于胚盤上下胚層細胞間距離很近，注射時顯微注射玻璃針非常容易刺破下層細胞，將液體注入卵黃中，致使病毒顆粒無法作用于胚盤原始生殖細胞而導致試驗失敗[16]。

在禽類胚胎血液循環系統建立后，其PGCs會進入血管隨血液循環遷移至原始生殖嵴部位，而后穿過血管壁進入原始生殖嵴中定居，并在其中生長、分裂、分化成配子。有研究表明[17-18]，將脂質體包裹的外源基因直接注射入第14期胚胎血液，轉染循環期的PGCs，在受體性腺區域可檢測到外源基因的表達。在胚胎發育至13～15期對胚胎血管進行顯微注射操作后，不僅不需要將胚胎換入代用蛋殼中培養，而且注射對胚胎生命力的影響要遠遠小于胚盤期注射的影響，孵化率相對較高[19]。因此，本研究在胚胎發育至13～15期時將慢病毒載體通過血管微注射方法導入鵪鶉胚胎，以期感染血液循環中的正在遷移的PGCs，通過孵化得到性系嵌合體個體，經過交配繁殖后代最終獲得轉基因個體。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 種蛋及HIV-1型慢病毒載體 鵪鶉種蛋購自宏達鵪鶉種場。所用HIV-1型慢病毒載體購自紐恩(上海)生物科技有限公司。載體信息見圖1。

1.1.2 試劑盒、耗材及工具酶 PCR預混液購自天澤生物技術有限公司，血液及精液基因組提取試劑盒、RNase A酶購自天根生物科技有限公司，精子基因組DNA提取試劑盒購自Promega公司，Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ購自羅氏公司，Southern雜交膜(Amersham-XL尼龍膜)購自GE公司，X光片購自Kodak 公司，顯影濃縮液及定影濃縮液購自樂凱公司，PCR引物的合成由上海英駿生物技術有限公司完成，限制性內切酶EcoR Ⅰ、PstⅠ購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 鵪鶉種蛋的處理 新鮮鵪鶉種蛋取回后，先用0.1%的新潔爾滅溶液清洗，除去表面污跡，然后用70%酒精噴灑消毒，待蛋殼表面晾干后放進孵化器里進行孵化，孵化溫度為37.5 ℃，相對濕度為55%～65%，每2 h 90°自動翻蛋。1.2.2 胚胎血管顯微注射慢病毒 將發育至13～15期的鵪鶉種蛋取出，上下輕輕晃動使胚胎脫離內層殼膜，通過纖維光源照蛋確定胚胎所處位置并用鉛筆在蛋殼上做好標記，用牙科鉆在記號附近打出一個直徑為4 mm左右的小孔；在解剖顯微鏡下用顯微注射器將1 μL(滴度為1×109TU·mL-1)慢病毒溶液緩慢注射到鵪鶉胚胎血管中，用parafilm膜封閉開口，標記后放回孵化器，繼續孵化至出雛。

LTR.長末端重復序列；Psi.包裝信號序列；RRE.呼長孤病毒應答元件；U6.U6啟動子；CMV.巨細胞病毒啟動子；eGFP.增強型綠色熒光蛋白基因序列；WRE.旱獺肝炎病毒轉錄后調控原件；SinLTR.自我滅活長末端重復序列。上面標示為以綠色熒光蛋白基因序列做探針檢測DNA雜交的大致位置；下面標示為限制性內切酶Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ大致的酶切位點LTR.Long terminal repeat；Psi.Packaging signal；RRE.Rev responsive element；U6.U6 promoter；CMV.Cytomegalovirus promoter；eGFP.Enhanced green fluorescent protein gene；WRE.Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element；SinLTR.Self-inactivating LTR.The approximate position of the probe for detecting the eGFP gene by Southern blotting analysis were indicated above the sequence.Restriction enzyme sites Pst Ⅰ and EcoR Ⅰ and locations of probe used for Southern blotting are depicted圖1 質粒載體pGCL-eGFP原理結構示意圖Fig.1 Diagram of the relevant regions of the pGCL-eGFP vector

1.2.3 外源基因eGFP在鵪鶉體內表達檢測 根據HIV-1慢病毒載體的表達特性，對胚胎血管顯微注射慢病毒后，分別在孵化第4天、剛孵化出3 d鵪鶉進行解剖后，在熒光顯微鏡下對各個組織器官內的綠色熒光蛋白的表達情況進行檢測。

1.2.4 PCR檢測 根據基因組提取試劑盒方法，對G0代雄性鵪鶉精液基因組及46只G1后代血液基因組提取后進行PCR檢測。參照慢病毒載體pGCL-eGFP中eGFP序列信息，利用Primer 5.0軟件設計引物，進行PCR擴增。上游引物：5′-CGGCCACAAGTTCAGCGTGTC-3′；下游引物：5′-CGATGGGGGTGTTCTGCTGGT-3′；擴增長度為497 bp的eGFP基因內部片段。PCR擴增體系25 μL；基因組DNA 2 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL，PCR預混液 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃30 s，64 ℃45 s，72 ℃30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。取PCR產物5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 Southern blot分析 對PCR檢測陽性的G1代個體及陰性對照個體，提取血液基因組10～20 μg，37 ℃水浴條件下，EcoR I和PstI雙酶切消化過夜，1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉移到尼龍膜上。根據質粒載體pGCL-eGFP序列，隨機引物法標記探針，PCR擴增出長876 bp DNA 片段，作為Southern blot的探針。地高鋅核酸探針標記Southern blot按羅氏公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ說明操作。

2 結 果

2.1 胚胎血管顯微注射慢病毒后孵化率統計

在進行正式試驗之前，對病毒載體進行了濃度梯度注射試驗，以便確定合適的劑量、滴度使試驗達到預期最佳效果。從孵化率、發育到性成熟期的成活率及性腺中綠色熒光蛋白的表達強弱等指標，確立孵化溫度為37.5 ℃，相對濕度55%～65%，每隔2 h 90°自動翻蛋，孵化46～48 h，注射劑量1 μL，病毒滴度 1×109TU·mL-1時試驗綜合效果最佳。病毒滴度過高，孵化率及成活率低；病毒滴度過低，性腺中綠色熒光蛋白的信號很弱。在該試驗中，胚盤下腔顯微注射體積1 μL、病毒滴度為1×109TU·mL-1鵪鶉種蛋80枚，孵化出雛48只，孵化率為60%。

2.2 血管顯微注射慢病毒早期綠色熒光蛋白基因表達的檢測

在注射慢病毒后的96 h即胚胎孵化的第6天，對操作過的胚胎進行了隨機解剖，在倒置熒光顯微鏡下對卵黃膜進行觀察，結果顯示：在隨機抽檢的胚胎中，全部生長發育正常，且在胚胎卵黃膜血管上觀察到綠色熒光蛋白的表達(圖2A)，說明在顯微注射體積1 μL、病毒滴度為1×109TU·mL-1，對早期胚胎發育沒有造成明顯的不良影響，且慢病毒載體攜帶的外源基因沒有出現基因沉默現象。

A.6 d的胚胎卵黃膜；B.喙部；C.羽毛；D.肝；E.腎；F.腸系膜；G.腺胃；H.小腸；I.大腸；J.血管；K.胸??；L.脾；M.心；N.輸卵管；O.眼部；P.大腦；Q.卵泡；R.骨骼肌A.eGFP expression in the vitelline membrane of 6 day-old embryo；B.Beak；C.Feather;D.Liver;E.Kidney;F.Mesenterium;G.Glandular stomach;H.Small intestine;I.Large intestine;J.Blood vessel;K.Breast muscle;L.Spleen;M.Heart;N.Oviduct;O.Eye;P.Brain of newly hatched G0 quails；Q.The follicle of sexually matured G0 quail;R.The skeletal muscle of G0 progeny圖2 血管微注射慢病毒載體嵌合體鵪鶉各組織中綠色熒光蛋白表達Fig.2 Expression of eGFP in tissues of hatched transgenic chimeric quail under the fluorescence microscopy.Lentiviral vector was injected into the blood vessels of embryos

2.3 新生鵪鶉不同內臟組織器官中綠色熒光蛋白基因表達的檢測

為了進一步驗證慢病毒載體攜帶的外源基因是否能夠持續表達，對試驗組出雛3 d鵪鶉隨機解剖后，將各組織臟器置于熒光顯微鏡下觀察，結果顯示：在新生鵪鶉的喙部、羽毛、肝、腎、腸系膜、腺胃、小腸、大腸、血管、胸肌、脾、心、輸卵管、眼部、大腦、卵泡及骨骼肌均檢測到綠色熒光的表達(圖2 B～R)。其中在眼部、心中的綠色熒光表達信號最強。另外，重點檢測了性腺中綠色熒光蛋白的表達情況，觀察到性腺(睪丸)中的綠色熒光蛋白廣泛性表達，說明在胚胎發育至13～15期，血管顯微注射慢病毒顆粒感染了此時期血液循環中正在遷移的原始生殖細胞，并通過血液循環遷移到性腺，并在性腺中分裂、增殖(圖3)。

2.4 G0代雄性鵪鶉精液、G1代鵪鶉血液基因組的PCR及Southern blot檢測

80枚鵪鶉種蛋，孵化出雛48只，至性成熟階段，用按壓式采精法對雄性鵪鶉進行采精，取21只雄性鵪鶉的精液，提取基因組后進行PCR檢測，其中5只個體精液基因組經PCR檢測為陽性，陽性率為23.8%(5/21)(圖4)，初步判定這5只雄性鵪鶉的部分精子中攜帶有外源目的基因。針對5只陽性鵪鶉，每只配對3只野生型雌性鵪鶉，分單籠飼養，每天收集產出的種蛋，標記后進行孵化。對新出雛的G1代鵪鶉飼養一周后腿部靜脈采血10 μL，提取基因組后進行PCR檢測，在5只雄性鵪鶉的46只G1后代中，有6只經PCR檢測為陽性，陽性率為13.0%(6/46)(圖5A)。為了進一步驗證試驗結果，對6只陽性個體進行了Southern blot檢測，雜交結果顯示6只陽性個體均為轉基因鵪鶉后代(圖5B)，說明在胚胎發育至13～15期血管顯微注射慢病毒載體成功制備出轉基因鵪鶉。

A.出雛3 d雄性鵪鶉左側睪丸的暗場；C.出雛3 d雄性鵪鶉右側睪丸的暗場；E.放大后雄性鵪鶉睪丸的暗場；B、D、F.3 d雄性鵪鶉睪丸對應的明場 A.Left testis of a 3 day-old male quail (Dark-field)；C.Right testis of 3 day-old male quail (Dark-field);E.Enlargement of part of the testis;B，D，F.Bright-field images圖3 血管顯微注射慢病毒載體后性腺中綠色熒光蛋白的表達Fig.3 Expression of eGFP in the gonads.Lentiviral vector was injected into the blood vessels of embryos

1～5.PCR檢測陽性個體；M.DNA相對分子質量標準；P.陽性對照； N.陰性對照1-5.PCR products of sexually matured G0 males produced by microinjection under the subgerminal cavity of the blastodermal embryo;M.DNA markers;P.Positive control;N.Negative control without microinjection of lentiviral vector圖4 G0代雄性鵪鶉精液基因組DNA的PCR檢測Fig.4 PCR analysis of genomic DNA extracted from semen of transgenic germ line chimeric(G0) quail

A.PCR檢測。1～6.G1代的6只陽性個體。M.DNA marker；P.陽性對照；N.陰性對照；B.6只陽性個體G1代血液基因組DNA的Southern blot檢測，1～6.血液基因組DNA(10 μg)經Pst I和EcoR I雙酶切后用引物做探針雜交；P.80 pg的pGCL-eGFP質粒；N.未注射慢病毒鵪鶉血液基因組DNAA.PCR analysis.1-6.The transgenic quails；M.DNA markers；P.Positive control；N.Negative control.B.Southern blot results.1-6 indicate G1 transgenic quails 1-6(as in A).Genomic DNA(10 μg) was digested with Pst I and EcoR I and hybridized with the eGFP probe；P.80 pg of pGCL-eGFP vector；N.Negative control without injection of lentiviral vector圖5 G1代鵪鶉血液基因組DNA的PCR(A)及Southern blot(B)檢測Fig.5 PCR and Southern blot analysis of genomic DNA from the blood of G1 transgenic quails

3 討 論

為了驗證胚胎早期血管顯微注射法的有效性，本試驗選擇了eGFP作為報告基因，通過熒光顯微鏡下的觀察可以直觀、快速地檢測到外源基因是否在受體表達。本試驗中，eGFP基因的表達是由CMV啟動子驅動，通過熒光顯微鏡檢測，在G0代新生鵪鶉的喙部、羽毛、肝、腎、腸系膜、腺胃、小腸、大腸、血管、胸肌、脾、心、輸卵管、眼、大腦、卵泡及骨骼肌中都檢測到了eGFP的表達(圖2)。特別是在胸肌、心及眼部觀測到eGFP的廣泛性表達(圖2)。這與M.J.McGrew等[7]報道的結果不同：由CMV啟動子驅動的eGFP在胰腺中陽性信號最強，在其它組織中只檢測到很弱的陽性信號。這種eGFP表達的組織差異及強度差異可能是由于試驗所使用的慢病毒載體不同造成的，本試驗所使用的慢病毒載體中包含了WRE調控元件，WRE是美洲旱獺肝炎病毒轉錄后調節元件，基因轉錄后WRE可以促進轉錄物出核，還可以通過上調初級轉錄物的多聚腺苷化來增加胞內信使核糖核酸的總量，最終提高外源基因的表達效率[20-21]。而M.J.McGrew等[7]所使用的慢病毒載體沒有此元件。

本試驗采取血管顯微注射法將慢病毒載體導入胚胎早期的血液循環系統，目的是使注入的慢病毒顆粒感染此時期在血液中正在遷移的PGCs。這種方法需要操作精細，技術條件要求較高。由于在注射時必須在蛋殼上開一個小孔并剪開蛋殼膜，破壞了胚胎發育的正常結構，改變了蛋殼內外的壓力平衡，容易造成胚胎血管與蛋殼的黏連，從而影響胚胎的正常發育。所以操作時需要顯微注射操作熟練，盡量減少開口種蛋停放時間；另外在蛋殼上打孔面積越小越好，盡量降低對種蛋完整性的破壞，才能保證注射過種蛋孵化率達到60%以上，遠高于周振明[19]的胚胎血管注射試驗的孵化率。目前報道較多的是通過胚盤下腔注射法導入病毒載體[6-7，22-24]，其胚胎孵化率為10%～40%，僅有一組研究人員報道了使用胚胎期血管微注射的方法制備轉基因禽類，其孵化率最高組可達89%，平均孵化率為63%[25]。在本試驗結果中，孵化率顯然高于胚盤下腔注射法，相比M.Kamihira等[26]血管注射法孵化率相近，結果是一致的。另外，有可能與eGFP在細胞內表達產生的毒性作用影響孵化率有關[27]，M.S.Kwon等[6]胚盤下腔顯微注射攜帶eGFP的逆轉錄病毒載體，雞胚孵化率僅為注射不含病毒液體組孵化率的1/3左右。從試驗結果看，胚胎血管顯微注射法與胚盤顯微注射法相比對胚胎發育的影響更小，胚胎孵化率高，在操作同樣數量的種蛋時，能夠獲得更多的G0個體。

在本試驗中，首先檢測了G0代雄性鵪鶉精液基因組eGFP的陽性率，在21只雄性鵪鶉中5只個體的精子基因組DNA經PCR檢測為陽性，陽性率為23.8%(5/21)，與一些報道[7，28-29]中的陽性率相比稍低，這可能與注射方式的不同以及慢病毒載體種類的不同有關。對5只陽性雄性鵪鶉測交46只后代檢測，有6只經PCR及Southern blot檢測為陽性，G1代轉基因的陽性率為13%(6/46)(圖5)。根據L.Pardanaud等[30]研究表明，鵪鶉第X期胚盤中僅有幾個PGCs，發育至12～13期時PGCs增加到90個左右，14～15期胚胎血液中的PGCs數量達到最高值。說明在胚胎發育不同時期，PGCs數目高低不同階段注射慢病毒感染PGCs可以獲取效果差異較大的轉染效率，從而最終影響轉基因效率。這也正是胚胎發育至13～15期血管顯微注射慢病毒載體后孵化出的G0代新生個體性腺中(圖3)eGFP基因廣泛性表達的主要原因。

4 結 論

本研究將慢病毒載體通過血管微注射方法導入發育至13～15期的鵪鶉胚胎，感染血液循環中正在遷移的PGCs，孵化后得到性系嵌合體，成功制備了轉基因鵪鶉后代。今后需進一步完善血管微注射法導入慢病毒載體的方法，并通過檢測轉基因后代中外源基因表達情況，改進并設計輸卵管特異性表達的慢病毒載體，為制備轉基因禽類生物反應器提供新的方法。

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(編輯 程金華)

Producing Transgenic Avian by Microinjection of Lentiviral Vector into the Early Embryo Blood Vessels

ZHANG Zi-fu*，ZHAO Yu，LIU Jin-ni，LI Xun，PENG Xin-liang，ZHANG Ping，HU Jing，HE Dong-yang，CHANG Jiao-jiao，GU Meng-di，JIN Nan-nan，WANG Ya-fang

(LaboratoryofBiotechnologyandAnimalReproduction,DepartmentofAnimalScience，XinyangCollegeofAgriculturalandForestry，Xinyang464000，China)

This study was aimed to identify the availability of early embryo blood vessels microinjection of lentiviral vector as a new，effective way in making transgenic birds，here，we combined some of the transgenic technology such as primordial germ cells(PGCs)，microinjection and lentiviral vector together according to the characteristic of bird development.The number of PGCs in the bloodstream was maximal when the chicken embryoes developed to Hamburger-Hamilton stage 13-15(HH13-15)，1 μL lentiviral vector，containing an enhanced-green fluorescent protein(eGFP)，was microinjected into the blood vessels of quail embryos at stage HH13-15 with a titer of 1×109TU·mL-1.A total of 80 embryos were injected and 48 quails(60%) were successfully hatched.In newly hatched quails，eGFP expression was shown as the presence of green fluorescence in the beak，feather，eye，brain，blood vessels，heart，liver，spleen，lung，kidney，glandular stomach，mesenterium，small intestine，large intestine，oviduct，muscle and claws，especially in gonads.In 5 out of 21 mature G0 male quails，the semen waseGFP-positive(5/21，23.8%)，as detected by polymerase chain reaction(PCR).Southern blot and genetic analyses revealed that in the 46 G1 offspring produced by G0 quail，6 were transgenic(6/46，13.0%) according to the PCR and Southern blot results.In conclusion，transgenic germ line chimeras was successfully generated by injection of lentiviral vector into embryonic blood vessel at stage HH 13-15.It indicated that infection of PGCs with lentiviral vector via direct injection into blood vessels has the potential to provide a more convenient and efficient way to produce transgenic birds.

microinjection;lentiviral vector;transgenic birds;enhanced green fluorescent protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.009

2015-03-04

信陽農林學院博士基金項目(201201020)；河南省博士后研發基地項目(2014-69)；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(B20143690)

張自富(1974-)，男，河南信陽人，講師，博士，主要從事動物轉基因研究

*通信作者：張自富，博士，E-mail：zzf5205@126.com

S814.8

A

0366-6964(2015)12-2185-07