弓形蟲截短SAG2基因的克隆表達與免疫活性分析

趙東岳，陳金鋒，韋劍輝

(福建師范大學南方生物醫學研究中心，福州 350117)

弓形蟲截短SAG2基因的克隆表達與免疫活性分析

趙東岳*，陳金鋒，韋劍輝

(福建師范大學南方生物醫學研究中心，福州 350117)

構建截短的弓形蟲表面抗原2(SAG2)原核表達系統，并探討其抗原活性。PCR擴增去掉信號肽和C-末端的SAG2基因片段，插入原核表達載體pGEX-4T-3后轉化到大腸桿菌DH5α，并用IPTG誘導。SDS-PAGE和Western blot鑒定重組SAG2t的表達及其免疫反應原性。每升菌液約純化出4 mg rSAG2t蛋白；Western blot顯示，ME49株感染的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可強烈識別表達的截短SAG2蛋白。原核表達體系實現了截短的SAG2蛋白的可溶性表達，并具有良好的完全抗原活性。

弓形蟲RH株/ME49株；免疫印記；截短SAG2基因

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是寄生在宿主有核細胞內的一種原蟲，作為機會致病病原，引起人畜患病。弓形蟲感染懷孕母畜后，侵害胎膜、侵染胎兒的大腦和肺[1]，可導致早產、流產、胎兒畸形，死胎。農場的貝類水生動物也有較高的弓形蟲感染率[2]，因此弓形蟲已經嚴重威脅人畜健康，弓形蟲病的防治刻不容緩。弓形蟲表面抗原2(SAG2)基因為單拷貝基因，無內含子，SAG2蛋白也具有1個游離的N-末端信號肽和疏水性的C-末端，被GPI錨定[3]。C.D.Yang等[4]誘導的嵌合蛋白rSAG1/2具有較強的免疫保護力；A.V.Machado等[5]制備的SAG2基因疫苗，能夠強烈刺激宿主的體液免疫和細胞免疫，因此SAG2抗原具有較強的免疫原性。本研究利用去除信號肽和C-末端的SAG2(438 bp)基因序列進行克隆并在大腸桿菌內進行高效表達，以便制備快速、準確的抗體檢測的相關試劑盒。

1 材料與方法

1.1 蟲株、質粒

剛地弓形蟲RH株由中國農業科學院蘭州獸醫研究所朱興全教授友情提供；ME49株、原核表達質粒pGEX-4T-3，牛新孢子蟲，均由福建師范大學黃曉紅教授友情提供。

1.2 主要試劑

限制性內切酶EcoRⅠ、DL5000 DNA marker、DL2000 DNA marker、Primixed protein marker (Low)、TaKaRa ExTaq等均購自TaKaRa公司；PVDF膜購自Milipore公司；Giutathione sepharoseTM4B購自GE Healthcare公司；DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自美國Axygen公司；預染蛋白Marker 購自美國Thermo公司。

1.3 引物的設計與合成

根據GenBank (FJ825705)所登錄的弓形蟲RH株SAG2基因序列，用Primer5.0設計信號肽(N-末端)和C-末端切割點之間的序列，預計擴增438 bp。上下游引物的5′端添加限制性內切酶EcoRⅠ的識別位點和2個保護性堿基其序列分別為GAATTC和AC。由上海生工合成，引物序列如下，F：ACGAATTCGTCCACCACCGAGACG；R：ACGAATTCTTACTTGCCCGTGAGA。

1.4 截短SAG2片段的PCR擴增

以提取的RH株弓形蟲全基因組為模板，根據TaKaRa ExTaq推薦的PCR反應體系進行優化，反應體系如下：TaKaRa ExTaq(5 U·μL-1)0.25 μL，10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus) 5 μL，DNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1)4 μL，模板DNA 2 μL，上游引物(10 μmol·L-1)和下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL，滅菌蒸餾水加至50 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環，72 ℃延伸10 min。擴增后的產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA，以備克隆。

1.5 重組質粒的克隆與鑒定

純化回收的截短SAG2的PCR擴增片段與表達載體pGEX-4T-3分別用限制性內切酶EcoRⅠ酶切暴露出黏性末端，經1.5%的瓊脂糖凝回收，并用紫外分光光度計測定濃度后，載體和目的基因SAG2t按照1∶3加樣，與等體積的SolutionⅠ混勻，16 ℃連接過夜。將連接產物轉化到大腸桿菌感受態細胞DH5α，涂布到含有100 μg·mL-1的氨芐青霉素LB固體瓊脂培養基上37 ℃過夜培養12～16 h后用高純質粒回收試劑盒回收重組質粒進行酶切鑒定。

1.6 重組蛋白SAG2t的誘導表達、純化

挑取1個含有pGEX-4T-3-SAG2t重組表達質粒的單克隆接種到含Amp(工作質量濃度100 μg·mL-1)的LB培養基，過夜培養12～16 h，過夜培養的菌液按照1∶100的比列接種到含有Amp的LB培養基37 ℃搖培，當OD600 nm為0.6～0.8時加入IPTG(工作濃度0.5 mmol·L-1)進行誘導，在優化的最佳誘導溫度25 ℃的條件下誘導4 h。離心收集菌體細胞，用4 ℃預冷TNE(含50 mmol·L-1Tris-Hcl pH8.0，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA)按照1∶50的比例懸浮菌體，并加入溶菌酶(工作質量濃度100 μg·mL-1)靜置一段時間后，經超聲破碎后，加入TritonX-100(工作濃度1%) 冰上放置30 min，促進蛋白質的溶解，離心后獲得可溶相和不可溶相。可溶相純化步驟按照Glutathione SepharoseTM4B(GE Healthcare)說明書操作。最后將可溶相，不可溶相，純化的產物進行SDS-PAGE分析。

1.7 Western blot分析

1.7.1 抗rSAG2t鼠血清的制備 由于rSAG2t含有GST標簽蛋白，所以免疫小鼠時做GST對照。GST是由含有pGEX-4T-3質粒的大腸桿菌經IPTG誘導表達產生，粗提及純化方法同1.6。試驗組小鼠注射100 μg的rSAG2t，對照組注射100 μg的GST。初次免疫：將500 μg蛋白質稀釋成1 000 μL，與等體積的弗氏佐劑進行乳化，分成5等分，分別注入5只小鼠腹腔；加強免疫：2周后以同樣的劑量蛋白懸液與等體積的弗氏不完全佐劑進行乳化后腹腔注射，再間隔2周后同樣的劑量、同方法再次加強免疫，10 d后頸總動脈取血，分離抗rSAG2t鼠血清。1.7.2 感染弓形蟲ME49株鼠血清制備 Vero細胞培養的弓形蟲弱毒株ME49蟲體，用PBS洗三遍，腹腔注射500只速殖子，感染前及感染后第7、10、14、20、27、38、45、54天分別經小鼠尾部取血，分離血清。

1.7.3 重組蛋白SAG2t的Western blot分析 純化rSAG2t蛋白進行SDS-PAGE分析，分離膠和濃縮膠的濃度分別是12%和5%，每塊膠在恒流25 mA條件下電泳進行濃縮，進入分離膠時轉化電流為50 mA，待溴酚藍指示劑移到接近凝膠底部時立即停止電泳，然后電轉印PVDF膜(濕轉印條件：每塊膠恒壓120 V，轉印60 min)；用5%的牛血清白蛋白(2.5 g，BSA用50 mL，1×TBST溶解)進行封閉；一抗：分別是弓形蟲感染的鼠血清和rSAG2t抗原免疫的鼠血清(1∶100稀釋)；二抗：標記紅色熒光的抗鼠IgG抗體(1∶3 000)稀釋。

1.8 重組蛋白SAG2t為包被抗原的ELISA檢測

用重組SAG2t包被酶標板，用ELISA方法分析感染弓形蟲ME49株的SPF鼠血清、SPF鼠陰性血清、感染新孢子蟲的SPF鼠血清，分析其抗原識別的特異性及其ME49株感染小鼠后特異性IgG抗體水平消長動態。

2 結 果

2.1 截短SAG2的擴增

從弓形蟲RH株全基因組DNA中擴增的截短SAG2t(438 bp)基因片段，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，發現在500 bp左右有一條清晰明亮的條帶(圖1)，與預期結果相同。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1. SAG2t片段；2.陰性對照M.DL2000 DNA marker；1.The fragment of SAG2t；2.Negative control圖1 去除信號肽和C-末端的SAG2編碼基因的擴增結果Fig.1 The amplification of encoding gene of SAG2 without signal peptide and c-terminal

2.2 重組質粒的酶切鑒定

pGEX-4T-3-SAG2t重組質粒進行PCR 擴增和酶切后，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在500和5 000 bp附近有兩條清晰明亮的條帶(圖2)。

M.DL5000 DNA相對分子質量標準；1.陰性對照；2.陽性對照；3.重組質粒的PCR鑒定；4.重組質粒pGEX-4T-3-SAG2t；5.pGEX-4T-3-SAG2t 重組質粒酶(EcoRⅠ)切產物M．DL5000 DNA marker；1.Negative control；2.Positive control；3.Identification of recombinant plasmid pGEX -4T-3-SAG2t by PCR；4.Recombinant plasmid of pGEX-4T-3-SAG2t；5.Identification of recombinant plasmid pGEX-4T-3-SAG2t by EcoRⅠ圖2 重組質粒pGEX-4T-3-SAG2t-PCR和雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pGEX-4T-3-SAG2t by PCR and restriction enzyme digestion

2.3 重組蛋白SAG2t的表達、純化及Western blot分析

將rSAG2t的表達和純化結果進行SDS-PAGE電泳后分析發現，rSAG2t的相對分子質量與預測的41 ku相符；rSAG2t產量很高，粗略估計每升菌液中約純化出4 mg高純度的抗原，見圖3。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.上清；2.沉淀；3.純化的重組蛋白質；4.GST對照；5～10.BSA，質量濃度分別為62.5、125、250、500、1 000和2 000 μg·mL-1M.Proteins with standard molecular mass；1.Soluble fraction；2.Insoluble fraction；3.Purified rSAG2t；4.GST；5-10.BSA with the concentration of 62.5，125，250，500，1 000 and 2 000 μg·mL-1圖3 SDS-PAGE分析rSAG2t的表達與純化結果Fig.3 The expression and purification of rSAG2t by using SDS-PAGE analysis

Western blot顯示，感染弓形蟲ME49株的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可強烈識別表達的截短SAG2蛋白，但是兩者均不與GST蛋白發生免疫反應，見圖4。

M.預染蛋白質相對分子質量標準；1.rSAG2t抗原+感染ME49株鼠血清；2.rSAG2t抗原+rSAG2t免疫鼠血清；3.GST抗原+感染ME49株鼠血清；4.GST抗原+rSAG2t免疫鼠血清M.Prestained-protein marker；1.rSAG2t+serum infected with T.gondii ME49 strain；2.rSAG2t+serum immunized by rSAG2t；3.GST+serum infected with T.gondii ME49 strain；4.GST+serum immunized by rSAG2t 圖4 Western blot分析顯示重組蛋白rSAG2t分別與感染ME49株鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清起強烈的抗原抗體反應Fig.4 rSAG2t reacted strongly between serum infected with T.gondii ME49 strain and serum immunized by rSAG2t using Western blot analysis

2.4 重組蛋白SAG2t為包被抗原的ELISA檢測

由圖5可見，rSAG2t(2 μg·mL-1)包被酶標板進行ELISA，發現感染弓形蟲ME49株的SPF鼠血清OD值升高，SPF鼠陰性血清和感染牛新孢子蟲的鼠血清OD值未升高，表明rSAG2t能夠特異性檢測出感染弓形蟲的抗體。圖6顯示，用ELISA追蹤感染ME49株小鼠血清在7～54 d的特異性IgG抗體水平消長動態，在感染7 d后可檢測到弓形蟲特異性IgG抗體，20 d后弓形蟲特異性IgG抗體水平達到高峰，隨后雖有所下降，但還是維持在較高的水平，該結果與IgG抗體水平消長的規律相符。

圖5 rSAG2t特異性試驗Fig.5 The specific test of rSAG2t

A、B、C、D、E、F、G、H.感染7、10、14、20、27、38、45、54 d特異性IgG抗體滴度A，B，C，D，E，F，G，H.Specific IgG antibody titers at 7，10，14，20，27，38，45 and 54 days post infection圖6 感染ME49株弓形蟲小鼠特異性IgG抗體消長動態Fig.6 Dynamic specific IgG antibody levels in T.gondii ME49-infected mouse

3 討 論

S.Tomavo等研究發現SAG2的N-端信號肽序列和C-末端脂錨錠蛋白具有高度的疏水性[6]。龍彩虹等構建pGEX-4T-2-SAG2t，在E.coliDH5α中誘導出去除前導信號肽的SAG2(477 bp)[7]。雷明軍等構建重組表達質粒pET23a-SAG2，在E.coliDH5α中誘導全長SAG2(500 bp)[8]。黃燕等構建pGEX-4T-SAG2t，在E.coliDH5α中誘導出去除疏水性信號肽的SAG2(451 bp)[9]。聶福旭等構建重組質粒pET23a-SAG2t，在E.coliBL21內誘導出去除前導信號肽的SAG2[10]。S.Li等利用基于rSAG2構建的rELISA方法，能夠特異性地應用于孕婦弓形蟲的檢測，可有效區分急、慢性感染[11]。Y.L.Lau等在畢赤酵母中成功克隆、表達出去掉一半N-末端的SAG2，并且能夠識別感染弓形蟲的血清[12]。Y.L.Lau等在畢赤酵母中表達出全長SAG2抗原蛋白，構建檢測人弓形蟲病ELISA方法不僅能夠檢測急性感染患者(IgM+、IgG-)，也能夠檢測慢性感染患者(IgM-、IgG+)[13]。

從上述文獻的報道來看，SAG2抗原蛋白，能夠特異性的識別感染弓形蟲的動物血清中IgM抗體和IgG抗體，但是上述文獻中所報道的SAG2抗原蛋白的表達量仍然比較低，為了提高SAG2抗原在大腸桿菌內高產量的表達，本研究根據SAG2基因序列的特點，去除疏水性的信號肽序列和C-末端序列SAG2(438 bp)亞克隆到高效表達載體pGEX-4T-3，并轉化到E.coliDH5α中進行高效誘導，結果表明每升菌液中可純化出的量高達4 mg。在試驗的過程中發現，IPTG的誘導終濃度在0.1～0.5 mmol·L-1之間誘導的量沒有明顯差異，與以上文獻報道的最佳IPTG濃度為0.1 mmol·L-1有所出入；試驗中還發現誘導的溫度對SAG2蛋白表達有至關重要的影響，本試驗優化的最佳誘導溫度為25 ℃時表達量最高，也與以上文獻報道的有所不同，究其原因可能與表達載體有密切關系。

SAG2t具有較高的敏感性和特異性，不與親緣關系近的新孢子蟲(N.caninum)發生交叉反應，并且能夠強烈刺激宿主的體液免疫產生較高的抗體水平，這為今后進一步改良快速免疫色譜試驗進行弓形蟲感染的免疫診斷奠定了基礎；同時抗重組蛋白抗體也可用于弓形蟲侵入宿主細胞的分子機制研究。另一方面將SAG2t蛋白與GST表達成融合蛋白，用親和層析的方式純化到可溶性蛋白質，克服了產量少、難純化的缺點，為弓形蟲SAG2蛋白的進一步研究奠定基礎。綜上所述，本試驗成功的克隆弓形蟲編碼的SAG2基因片段，并在大腸桿菌中高效表達，重組蛋白質具有良好的抗原性和免疫原性，具有潛在的應用價值。

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(編輯 白永平)

Prokaryotic Soluble Expression of Truncated SAG2 Protein of

Toxoplasmagondiiand Its Antigenic Activity ZHAO Dong-yue*，CHEN Jin-feng，WEI Jian-hui

(SouthernBiomedicalResearchCenteratFujianNormalUniversity，Fuzhou350117，China)

To expressSAG2 gene ofToxoplasmagondiiby prokaryotic expression system and to identify its antigenicity，truncatedSAG2 without the highly hydrophobic signal peptide and C-terminus were amplified by PCR，and recombinant prokaryotic expression plasmid (pGEX-4T-3-SAG2t) with SAG2t protein gene was constructed.Then the recombinant plasmids were transferred intoE.coliDH5α，and the bacteria were induced by IPTG.The expression and immune-reactivity of SAG2t protein were detected by SDS-PAGE and Western blotting respectively.The yield of purified rSAG2t was more than 4 mg per liter of culture medium.Western blot showed that rSAG2t can be strongly recognized by mice serum infected withT.gondiiME49 strain and mice serum immunized by rSAG2t .The result showed that the soluble expression of SAG2t protein with favorable complete antigenic activity was implemented by prokaryotic expression system.

RH/ME49 strain ofToxoplasmagondii；Western blot；truncatedSAG2

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.018

2014-10-11

國家衛生和計劃生育委員會科研基金(WKJ-FJ-28)

趙東岳(1985-)，山東高青人，碩士，實驗師，主要從事動物病原與分子生物學研究，E-mail:296158826@qq.com

*通信作者：趙東岳，Tel：0591-22868832，E-mail：mountainous@163.com

S852.729

A

0366-6964(2015)12-2258-06