針刺預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠膽堿能抗炎通路的影響研究

秦彥強(qiáng)，孫忠人，張亞娟，高利權(quán)，史術(shù)峰

·論著·

針刺預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠膽堿能抗炎通路的影響研究

秦彥強(qiáng)，孫忠人，張亞娟，高利權(quán)，史術(shù)峰

目的探討針刺預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠膽堿能抗炎通路(CAP)的影響。方法選擇40只健康成年SD雄性大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組(A組)、假手術(shù)組(B組)、腦梗死組(C組)、針刺預(yù)處理組(D組)和針刺預(yù)處理+甲基牛扁亭(MLA)組(E組)，各8只。A組大鼠不做任何處理;B組大鼠只切開(kāi)皮膚，暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，不插入線栓，術(shù)后縫合皮膚;C組大鼠采用改良Zea Longa方法制備腦梗死模型;D組于造模前7 d開(kāi)始針刺治療;E組大鼠于針刺同時(shí)腹腔注射MLA，5 mg/kg，1次/d，連續(xù)治療7 d。各組大鼠于造模成功后同步飼養(yǎng)，自由飲食，3 d后處死。于處死前采用Longar 5分制評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分;取處死大鼠新鮮腦組織頂葉皮質(zhì)采用甲醛固定，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;剩余腦組織采用液氮保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)TNF－α、IL－1β水平，采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)mRNA表達(dá)情況。結(jié)果C組、D組、E組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞多于A組和B組，腦組織中TNF－α、IL－1β水平高于A組和B組(P＜0.05);C組和E組大鼠α7nAChR mRNA相對(duì)表達(dá)量低于A組和B組(P＜0.05);D組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞少于C組和E組，神經(jīng)功能評(píng)分低于C組和E組，腦組織中TNF－α、IL－1β水平低于C組和E組，α7nAChR mRNA相對(duì)表達(dá)量高于C組和E組(P＜0.05)。結(jié)論針刺預(yù)處理可以改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能，抑制神經(jīng)元凋亡，降低炎性細(xì)胞因子水平，上調(diào)α7nAChR mRNA的表達(dá)。

腦梗死;針刺穴位;細(xì)胞凋亡;炎癥趨化因子;膽堿能抗炎通路;大鼠

秦彥強(qiáng)，孫忠人，張亞娟，等.針刺預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠膽堿能抗炎通路的影響研究［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2015，23(3):29－33.［www.syxnf.net］

Qin YQ，Sun ZR，Zhang YJ，et al.Impact of acupuncture preconditioning on cholinergic anti－inflammatory pathway in rats with cerebral infarction［J］.Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(3):29－33.

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人口老齡化進(jìn)一步加重，目前腦血管疾病已成為我國(guó)三大致死性疾病之一［1］。腦血栓形成在腦血管疾病中占1/3，由于中樞神經(jīng)元損傷不可逆、無(wú)法自然恢復(fù)而遺留殘疾，重則危及患者生命。因此，許多專家學(xué)者意識(shí)到，最大限度地提高腦損傷耐受能力可能是阻斷腦血管疾病惡性循環(huán)的有力手段。缺血耐受的提出為腦梗死的預(yù)防性治療提供了廣闊的思路，也提出了多種預(yù)處理方式誘導(dǎo)腦缺血耐受。但腦缺血耐受的具體腦保護(hù)作用機(jī)制尚未明確，值得肯定的是炎性反應(yīng)在缺血性腦損傷中占重要地位［2］，且貫穿于腦缺血性損傷病理發(fā)展的始終，在腦損傷早期局部腦組織就會(huì)大量釋放炎性因子［3］。因此，針對(duì)急性缺血性腦卒中神經(jīng)炎癥通路的定向治療已成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重要課題［4］。

近期研究發(fā)現(xiàn)，膽堿能抗炎通路(cholinergic antiinflammatory pathway，CAP)是一種神經(jīng)－免疫調(diào)節(jié)通路。CAP的激活能夠有效減少機(jī)體內(nèi)多種促炎因子的釋放，在全身和局部炎性反應(yīng)過(guò)程中均存在明顯的抑制作用。CAP發(fā)揮作用的中樞環(huán)節(jié)是抑制乙酰膽堿(Ach)與免疫細(xì)胞上的α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)結(jié)合，激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF－κB)信號(hào)通路和蛋白酪氨酸激酶2與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2/ STAT3)信號(hào)通路，從而抑制機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生與釋放［5］。本研究的前期研究結(jié)果證實(shí)，針刺風(fēng)池穴預(yù)處理可以改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能、誘導(dǎo)腦缺血耐受，但針刺風(fēng)池穴誘導(dǎo)腦缺血耐受的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。因此，本研究探討了針刺預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠CAP的影響，試圖從CAP角度揭示針刺預(yù)處理腦保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康成年SD雄性大鼠40只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，平均體質(zhì)量(330±10)g，合格證號(hào)為黑201302415號(hào)。

1.2 主要試劑TUNEL測(cè)試試劑盒(美國(guó)Roche公司，批號(hào):11772465001)，DBA工作液現(xiàn)用現(xiàn)配;DEPC (美國(guó)Sigma公司);甲基牛扁亭(MLA)(美國(guó)Sigma公司);TransZol Up(北京全式金生物技術(shù)有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒TAKAR(大連寶生物);實(shí)時(shí)定量熒光PCR試劑盒TAKARA(大連寶生物);α7nAChR及βactin mRNA引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;腫瘤壞死因子α(TNF－α)、白介素1β(IL－1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器酶標(biāo)儀(450 nm波長(zhǎng)濾光片):北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司;光學(xué)顯微鏡(MCL－300):美佳朗;電熱恒溫箱(DHP－9052):上海一恒公司;華佗牌針灸針(0.25×25 mm):蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;高精度移液器(WKYIII－5):上海佳安分析儀器廠;實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(ABI－7500):美國(guó)ABI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組(A組)、假手術(shù)組(B組)、腦梗死組(C組)、針刺預(yù)處理組(D組)、針刺預(yù)處理+MLA組(E組)，各8只。A組大鼠同步喂養(yǎng)，不做任何處理;B組大鼠只切開(kāi)皮膚，暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，不插入線栓，術(shù)后縫合皮膚;C組大鼠采用改良Zea Longa方法制備腦梗死模型;D組大鼠于造模前7 d開(kāi)始針刺治療;E組大鼠于針刺同時(shí)腹腔注射MLA，5 mg/kg，1次/d，連續(xù)治療7 d。

1.2.2 腦梗死動(dòng)物模型制備方法采用改良Zea Longa［6］方法。動(dòng)物造模前6 h禁食，10%水合氯醛腹腔麻醉，于頸部距正中線右側(cè)0.5 cm切開(kāi)頸部皮膚，剝離至暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈近段，血管夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈剪一小口，插入備好線栓，固定，松開(kāi)動(dòng)脈夾，將線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈送入至大腦前動(dòng)脈，栓塞大腦中動(dòng)脈，制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞腦梗死模型。模型制備成功標(biāo)準(zhǔn):動(dòng)物清醒后，采用Longar 5分制進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分≥2分為模型制備成功。

1.2.3 針刺預(yù)處理針刺大鼠雙側(cè)“風(fēng)池”穴，即枕骨后緣夾肌與肩斜方肌之間，左右距前正中線約1 cm處，30 min/次，1次/d，連續(xù)針刺7 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于造模成功后同步飼養(yǎng)，自由飲食，3 d后處死。于處死前采用Longar 5分制評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分;取處死大鼠新鮮腦組織

頂葉皮質(zhì)采用甲醛固定，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;剩余腦組織采用液氮保存，采用ELISA檢測(cè)TNF－α、IL－1β水平，采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀檢測(cè)α7nAChR mRNA表達(dá)情況。

1.3.1 Longar 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)0分:無(wú)神經(jīng)功能缺損，動(dòng)物行為正常;1分:提尾時(shí)左前肢內(nèi)收，不能完全伸展;2分:自發(fā)行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走或昏迷。

1.3.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡各實(shí)驗(yàn)組大鼠于取材前6 h禁食水，取新鮮腦組織頂葉皮質(zhì)腦缺血損傷邊緣區(qū)組織進(jìn)行甲醛固定，石蠟包埋，應(yīng)用TUNEL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，具體步驟如下:(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;(2)滴加胃蛋白酶K(20μg/ml溶于10 mM的Tris/HCL中，pH值7.4～8.0)室溫孵育30 min，PBS沖洗2次;(3)標(biāo)記:擦干樣品周圍的水，滴加50 μl的Tunel反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS沖洗3次;(4)信號(hào)轉(zhuǎn)化和分析:擦干樣品周圍的水分，加入50 μl的轉(zhuǎn)化劑POD，在濕盒中37℃孵育30 min，PBS沖洗3次;(5)顯色:滴加顯色劑DBA，室溫下10 min，蒸餾水充分沖洗;(6)蘇木素復(fù)染1 min; (7)常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。應(yīng)用Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)，每張片隨機(jī)觀察并計(jì)數(shù)腦損傷區(qū)周圍組織5個(gè)不重復(fù)視野，在400倍鏡視野下計(jì)數(shù)腦損傷區(qū)周圍組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。取平均值作為每個(gè)標(biāo)本高倍視野內(nèi)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(個(gè)/ HP)。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)腦組織中TNF－α、IL－1β水平各實(shí)驗(yàn)組大鼠取梗死邊緣腦組織5 mg，液氮保存待用。按照大鼠ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟測(cè)定組織TNF－α、IL－1β水平。具體步驟如下:(1)在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各100 μl，37℃孵育90 min;(2)倒去孔內(nèi)液體，加入100 μl生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min;(3)洗滌3次;(4)加入100 μl酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30 min;(5)洗滌5次;(6)加入90 μl底物溶液，37℃孵育15 min;(7)加入50 μl終止液，立即在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值;(8)計(jì)算結(jié)果。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)α7nAChR mRNA的表達(dá)(1)樣本RNA提取:取每組大鼠腦組織研磨成粉末，加入1 ml的TriZol試劑，混勻，室溫靜置5 min，提取總RNA;(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):2 μg RNA按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，42℃30 min，85℃5 min;(3) PCR反應(yīng):按組分〔SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl、PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μl、PCR Reverse Primer (10 μM)0.5 μl、DNA模板1.0 μl、滅菌蒸餾水10.5 μl〕分別配制實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)體系，各樣品的目的mRNA和內(nèi)參(GAPDH)分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng);(4)計(jì)算結(jié)果:實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀中制備標(biāo)準(zhǔn)品，溶解曲線的吸收峰單一的PCR產(chǎn)物為合格標(biāo)準(zhǔn)品。β－actin基因作為內(nèi)參基因，分別采集α7nAChR、β－actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)。Rotor－Gene 6.0版軟件收集循環(huán)閾值(CT值)，目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)量計(jì)算按照公式:目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)量=2－△△CT。實(shí)時(shí)定量熒光PCR基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量熒光PCR基因引物序列Table 1 Sequences of gene primers of real－time PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分A組和B組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均為0分、C組為(2.17±0.48)分、D組為(1.24±0.58)分、E組為(2.24±0.46)分，C組、D組和E組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.61，P=0.00)，其中D組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分低于C組和E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為5.16、5.55，P＜0.05)。

2.2 各組大鼠細(xì)胞凋亡情況A組和B組可見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(見(jiàn)圖1A)，C組(見(jiàn)圖1B)、D組(見(jiàn)圖1C)和E組(見(jiàn)圖1D)3 d時(shí)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較多，但D組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于C組和E組。A組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為(10.05±2.15)個(gè)/HP、B組為(11.97±2.35)個(gè)/HP、C組為(18.34±4.28)個(gè)/ HP、D組為(14.57±3.48)個(gè)/HP，E組為(17.75 ±3.87)個(gè)/HP。各組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.27，P=0.00);其中C組、D組、E組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞多于A組和B組，D組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞少于C組和E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠腦組織中TNF－α、IL－1β水平及α7nAChR mRNA相對(duì)表達(dá)量各組大鼠腦組織中TNF－α、IL－1β水平和α7nAChR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中C組、D組和E組大鼠腦組織中TNF－α、IL－1β水平高于A組和B組，C組和E組大鼠α7nAChR mRNA相對(duì)表達(dá)量低于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);D組大鼠

腦組織中TNF－α、IL－1β水平低于C組和E組，α7nAChR mRNA相對(duì)表達(dá)量高于C組和E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表2)。

圖1 各組大鼠腦梗死邊緣TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞情況(TUNEL法染色，×400)Figure 1 TUNEL positive cells in cerebral infarction edge in each group of rat

表2 各組大鼠腦組織中TNF－α、IL－1β水平及α7nAChR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)Table 2 Comparison TNF－α，IL－1β level of brain tissues and relative expression of a7nAChR mRNA in each group of rat

表2 各組大鼠腦組織中TNF－α、IL－1β水平及α7nAChR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)Table 2 Comparison TNF－α，IL－1β level of brain tissues and relative expression of a7nAChR mRNA in each group of rat

注:A組=正常組，B組=假手術(shù)組，C組=腦梗死組，D組=針刺預(yù)處理組，E組=針刺預(yù)處理+MLA組;TNF－α=腫瘤壞死因子α，IL－1β=白介素1β，α7nAChR=α7煙堿型乙酰膽堿受體;與A組和B組比較，*P＜0.05;與D組比較，▲P＜0.05

組別例數(shù)TNF－α (ng/ml)相對(duì)表達(dá)量A組(ng/ml)α7nAChR mRNA IL－1β 88.15±2.513.28±1.3412.72±0.37 B組89.00±1.344.83±2.578.10±0.65 C組813.47±2.72＊▲10.45±2.43＊▲7.42±0.62＊▲D組811.08±1.83*7.18±1.59*10.76±1.15*E組814.04±3.30＊▲10.01±2.05＊▲7.67±1.07＊▲F 0.000.000.00 9.2018.7462.89 P值值

3 討論

“治未病”理論早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有提及，“未病”一般定義為“體內(nèi)已有病因存在但尚未致病的人體狀態(tài)”。治未病與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的預(yù)處理理念不謀而合，因此，挖掘治未病手段誘導(dǎo)腦缺血耐受具有現(xiàn)實(shí)意義。針刺風(fēng)池穴可以調(diào)節(jié)椎基底動(dòng)脈血流［7］，改善腦供血情況及腦血流，可治療腦供血不足引起的眩暈;還具有降低交感神經(jīng)緊張度、興奮迷走神經(jīng)的作用。但其是否存在誘導(dǎo)CAP而抗細(xì)胞凋亡、抑制炎癥、改善腦損傷的作用尚不清楚。

缺血性腦血管疾病是以腦動(dòng)脈粥樣硬化為基礎(chǔ)、以腦組織缺血缺氧性損傷為主要病理改變的疾病。炎性反應(yīng)在缺血性腦血管疾病中占重要地位，腦組織發(fā)生缺血缺氧可以激活一系列炎性轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，導(dǎo)致Toll樣受體和核轉(zhuǎn)錄因子等被激活，誘導(dǎo)下游產(chǎn)生TNF－α［8］、IL－1β［9］和金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP－9)等，進(jìn)一步損傷神經(jīng)元細(xì)胞膜和細(xì)胞器，使神經(jīng)元發(fā)生腫脹、變性甚至壞死，最終誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［10］。

CAP以神經(jīng)－免疫調(diào)節(jié)的方式在缺血性腦損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，分布在效應(yīng)器上的膽堿能受體根據(jù)其藥理反應(yīng)可分為毒蕈堿型乙酰膽堿受體(mAChR)和煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)，mAChR屬于G－蛋白耦聯(lián)受體家族，nAChR屬于離子通道受體家族。多數(shù)實(shí)驗(yàn)證明，免疫細(xì)胞發(fā)揮膽堿能調(diào)控作用主要與α7nAChR相關(guān)，α7nAChR激動(dòng)劑可抑制局部或全身炎性反應(yīng)［11］。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以表達(dá)α7nAChR，Shytle等［12］研究表明，煙堿和ACh可阻斷LPS介導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF－α。同時(shí)煙堿還可以升高小膠質(zhì)細(xì)胞環(huán)氧化酶2(COX2)的表達(dá)，從而降低細(xì)胞炎性因子的表達(dá)。這種調(diào)控作用可被α7nAChR拮抗劑、α－銀環(huán)蛇毒素阻斷［13］。MLA是α7nAChR拮抗劑，可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，拮抗α7nAChR的抗炎作用［14］。本研究從CAP方面探討針刺預(yù)處理發(fā)揮腦保護(hù)作用的具體機(jī)制，結(jié)果顯示C組、D組和E組大鼠造模3 d時(shí)神經(jīng)功能均有缺損，但D組神經(jīng)功能評(píng)分低于C組和E組，提示針刺預(yù)處理能更好地改善腦梗死后神經(jīng)功能缺損程度、發(fā)揮腦缺血耐受作用，但針刺預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用可被α7nAChR拮抗劑MLA所阻斷。

細(xì)胞凋亡是腦損傷后神經(jīng)組織細(xì)胞發(fā)生的一系列生物學(xué)特征性改變，在缺血性腦損傷早期，炎性因子導(dǎo)致缺血區(qū)腦組織發(fā)生大量細(xì)胞凋亡，是繼發(fā)性腦損傷的病理生理過(guò)程［15］。TUNEL法可以對(duì)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，并能準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)及形態(tài)學(xué)改變。本研究結(jié)果顯示，C組、D組和E組大鼠均存在TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，但D組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于C組，表明針刺預(yù)處理具有抗細(xì)胞凋亡作用。但E組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞與C組接近，且多于D組，提示針刺預(yù)處理的抗細(xì)胞凋亡作用可以被α7nAChR拮抗劑MLA所阻斷。

腦梗死后會(huì)發(fā)生一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，眾多的促炎因子、抗炎因子均參與了腦梗死的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。TNF－α由單核細(xì)胞分泌，屬于炎性反應(yīng)中最先激活細(xì)

胞因子之一，參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程。IL－1β是一種重要的炎性因子，發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)可進(jìn)一步激活中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，形成級(jí)聯(lián)式瀑布反應(yīng)，并最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和凋亡。本研究結(jié)果顯示，C組和D組大鼠缺血損傷后3 d腦組織中TNF－α、IL－1β水平升高。但D組大鼠腦組織中TNF－α、IL－1β水平低于C組，提示針刺預(yù)處理具有減輕腦梗死后炎性反應(yīng)的作用;E組大鼠腦組織中TNF－α、IL－1β水平高于D組，提示針刺預(yù)處理的抗炎作用可以被α7nAChR拮抗劑MLA所阻斷。本研究采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法檢測(cè)腦組織中a7nAChR mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明針刺預(yù)處理可以上調(diào)α7nAChR mRNA的表達(dá)，而E組較D組大鼠α7nAChR mRNA的表達(dá)下調(diào)。

綜上所述，針刺預(yù)處理可以改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能，抑制神經(jīng)元凋亡，減輕腦梗死后炎性反應(yīng)，且可以上調(diào)α7nACh mRNA的表達(dá)，針刺預(yù)處理的腦保護(hù)作用可以被α7nAChR拮抗劑MLA所逆轉(zhuǎn)。推測(cè)CAP在針刺預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

［1］王北松.缺血性腦血管病研究近況與中醫(yī)治療概略［J］.中醫(yī)藥信息，2001，18(3):2－4.

［2］Jin R，Liu L，Zhang S，et al.Role of inflammation and its mediators in acute ischemic stroke［J］.J Cardiovasc Transl Res，2013，6 (5):834－851.

［3］Berti R，Williams AJ，Moffett JR，et al.Quantitative real－time RT－PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia－reperfusion brain injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22(9):1068－1079.

［4］Swanson RA，Ying W，Kauppinen TM.Astrocyte influences on ischemic neuronal death［J］.Curr Mol Med，2004，4(2):193－205.

［5］劉曉潔，梅志剛，王明智.膽堿能抗炎通路:缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)的可能調(diào)節(jié)機(jī)制［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33(5): 1211－1213.

［6］Longa EZ，Weinstein PR，Carison S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84－91.

［7］袁曉軍，郝喜書，賴仲平，等.針刺風(fēng)池穴對(duì)腦血流的影響［J］.中醫(yī)雜志，1996，37(5):285－286.

［8］Watters O，O'Connor JJ.A role for tumor necrosis factor－α in ischemia and ischemic preconditioning［J］.J Neuroinflammation，2011.doi:10.1186/1742－2094－8－87

［9］Strecker JK，Minnerup J，Gess B，et al.Monocyte chemoattractant protein－1－deficiency impairs the expression of IL－6，IL－1β and G－CSF after transient focal ischemia in mice［J］.PLoS One，2011，6(10):e25863.

［10］Majumder S，Ilayaraja M，Seerapu HR，et al.Chick embryo partial ischemia model:a new approach to study ischemia ex vivo［J］. PLoS One，2010，5(5):528.

［11］李祺，劉霞.膽堿能抗炎通路的信號(hào)機(jī)制研究［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2010，28(5):325－327.

［12］Shytle RD，Mori T，Townsend K，et al.Cholinergic modulation of microglialactivationbyalpha7nicotinicreceptors［J］.J Neurochem，2004，89(2):337－343.

［13］Hu J，Zhu C，Liu Y，et al.Dynamic alterations of gene expression of nicotinic acetylcholine receptor a7，a4 and a2 subunits in an acute MPTP－lesioned mouse model［J］.Neurosci Lett，2011，494 (3):232－236.

［14］Liu Y，Hu J，Wu J，et al.α7 nicotinic acetylcholine receptormediated neuroprotection against dopaminergic neuron loss in an MPTP mouse model via inhibition of astrocyte activation［J］.J Neuroinflammation，2012.doi:10.1186/1742－2094－9－98

［15］Raghupathi R，Conti AC，Graham DI，et al.Mild traumatic brain injury induces apoptotic cell death in the cortex that is preceded by decreases in cellular Bcl－2 immunoreactivity［J］.Neuroscience，2002，110(4):605－616.

Impact of Acupuncture Preconditioning on Cholinergic Anti－inflammatory Pathway in Rats with Cerebral Infarction

QIN Yan－qiang，SUN Zhong－ren，ZHANG Ya－juan，et al．
Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China

ObjectiveTo explore the impact of acupuncture preconditioning on cholinergic anti－inflammatory pathway in rats with cerebral infarction.MethodsA total of 40 adult male SD rats were randomly divided into groups A，B，C，D，E，each of 8 cases.Rats of A group were given normal feeding，rats of B group were given sham－operation(cut the skin and exposed carotid general artery，external carotid artery，internal carotid artery，did not insert line－lock，then suture the skin)，rats of C group were prepared for cerebral infarction model according to modified Zea Longa method，rats of D group were given acupuncture preconditioning 7 days before modeling，rats of E group were given acupuncture preconditioning and methyllycaconitine 7 days before modeling.All of the rats were killed 3 days after modeling，and neurological score was evaluated by Longar 5－grade method before killing.Fresh parietal lobe cortex were collected and fixed by formaldehyde，and TUNEL method was used to detect the cell apoptosis;other brain tissues were kept by liquid nitrogen，and ELISA was used to detect the TNF－α and IL－1β levels，real－time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression of α7nAChR mRNA. ResultsTUNEL positive cells of groups C，D，E were more than those of groups A and B，respectively;TNF－α and IL－1β levels of groups C，D，E were higher than those of groups A and B，respectively;while the expression of α7nAChR mRNA of

Brain infarction;Acupuncture points;Apoptosis;Inflammatory chemokines;Cholinergic antiinflammatory pathway;Rats

R 743.33

A

10.3969/j.issn.1008－5971.2015.03.009

2014－12－10;

2015－03－10)

(本文編輯:謝武英)

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30873298)

150040黑龍江省哈爾濱市，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)(秦彥強(qiáng)，孫忠人，高利權(quán));哈爾濱市第二醫(yī)院(秦彥強(qiáng)，張亞娟);北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬三院(史術(shù)峰)

孫忠人，150040黑龍江省哈爾濱市，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);E－mail:szr006@163.com

groups C，E were lower than those of groups A and B，respectively(P＜0.05).TUNEL positive cells of D group were less than those of groups C and E，respectively;neurological score，TNF－α and IL－1β levels of D group were lower than those of groups C and E，respectively;while the expression of α7nAChR mRNA of D group were higher than those of groups C and E，respectively(P＜0.05).ConclusionAcupuncture preconditioning can improve neurological function in rats with cerebral infarction，inhibit neuronal apoptosis and reduce inflammatory cytokines levels，raise the expression of 7nAChR mRNA.