產油酵母發酵中遇到的問題初探

金洪波 畢生雷 喬建援 劉 鉞 杜風光 郝生印

（河南天冠企業集團有限公司，河南 南陽 473000）

生物柴油是一種優質清潔柴油， 原料可以從各種含油生物中獲得，可以說是取之不盡、用之不竭的能源。 生物柴油具有環保、安全、可降解、可再生以及燃燒性能優良等優點，在資源日益枯竭的今天，在能源領域擁有重要的地位和廣闊的發展前景， 有望取代石化柴油成為替代燃料。

據報道，2013年中國有近300 萬噸的生物柴油產能，但是由于原料短缺，實際產量還不足90 萬噸。 因此原料短缺嚴重制約了生物柴油產業的發展。

產油微生物是上世紀50年代興起的研究熱點，它的優勢在于培養周期比較短，正常情況下，產油微生物生長周期僅3-20 天，產油微生物胞內優質含量高達50-80%，占地面積相對傳統產油原料來說要少得多。 作為異養產油微生物的代表， 華東理工大學的李元廣團隊培養的小球藻終了生物量可以達到144g/L， 中科院大連化物所的趙宗保團隊培養的圓紅冬孢酵母終了生物量更是高達180g/L 以上。 產油微生物的產率高、油脂含量高、生長周期短、占地面積較少的優點贏得了廣大研究人員的關注。

天冠集團與清華大學、中科院大連化物所合作，進行了異養小球藻和圓紅冬孢酵母發酵法制備生物柴油原料的實驗[1-2]，在實驗過程中，課題組發現使用發酵法培養具有明顯的比較優勢。 本文著重分析了產油酵母的一些優勢和發酵中出現的問題。

1 產油酵母發酵具備的一些優勢

1.1 發酵中的原料成本較低

圓紅冬孢酵母相對其他產油脂的的發酵過程來說具有一定優勢，酵母細胞中含油量高（高達60%-70%），而且產油酵母轉化率高（葡萄糖/干粉轉化率可達50%，葡萄糖/油脂轉化率可達30%），因此生產相同數量的油脂需要培養基原料、發酵過程中補料相對較少。 而且產油酵母發酵過程所用的原料比較單一，僅葡萄糖、酵母粉、蛋白胨等四五種， 遠遠低于其他產油微生物培養所需要的原料種類[3]。 中科院大連化物所的研究成果還表明，圓紅冬孢酵母可以利用菊芋、秸稈等廉價原料，而且生產效率與葡萄糖等高價值原料相差無幾。 這些都使得原料成本相對較低。

1.2 發酵中的能耗成本較低

圓紅冬孢酵母的生長速度較快， 相對其他產油脂的發酵過程來說，在發酵周期方面，圓紅冬孢酵母由于每天干重增加量高（每天干重增加量可以達到15-20g/L*D），而其他產油微生物一般在異養培養條件下每天干重增加量僅4-9g/L*D，在自養條件下每天干重增加量還不足2g/L*D，生產效率提高了近10 倍。因此生產相同數量的油脂需要的發酵時間相對較短。 對于自養發酵來說，培養時間縮短，那么通入二氧化碳所需要的泵、壓縮機的耗電量就少，對于異養發酵來說，培養時間縮短，那么通風量、攪拌耗電量都會大大縮短。 因此培養時間縮短意味著消耗的電、風、水均相對減少。 同時，在圓紅冬孢酵母的培養過程中，異養培養是產熱的過程，而其他自養產油微生物在培養過程中，為了保持環境中溫度和濕度的恒定，往往需要使用外在熱源升溫， 這意味著產油酵母異養培養過程與其他自養產油微生物相比節省了大量的加熱成本。

1.3 控制條件寬松，利于工業生產

圓紅冬孢酵母在發酵過程中對葡萄糖的耐受范圍寬，最高濃度高達15%，作為工業化生產，可以一次補料到10%以上，從而2-3 天補料一次即可。 較高的葡萄糖耐受范圍可以使培養過程補料的次數減少， 而其他產油微生物在發酵過程中， 一般來說耐受葡萄糖濃度最高僅6%。超過最高濃度，將抑制微生物的正常生長和產油的效率。 另外，圓紅冬孢酵母生長比較迅速，在24 小時即可形成種群優勢， 其他產油微生物往往需要培養6 天以上才能獲得比較明顯的種群優勢，與其他產油微生物相比，染菌機率明顯降低， 對普通工人的操作水平的要求也相對較低。 因此發酵操作相對寬松，意味著生產管理更適合普通工人操作。

1.4 染菌機率較低

圓紅冬孢酵母在短期內獲得了種群優勢， 使得除霉菌外其他雜菌影響圓紅冬孢酵母生長、 產油的概率幾乎為零。 其他產油微生物在自養條件下，由于培養液中營養豐富，容易受到蟲子、細菌的污染，從而影響產油微生物的正常生長以及烘干以后干粉的品質。 其他產油微生物在異養條件下， 由于需要較長的時間才能完成細胞數量的積累，因此在獲得種群優勢之前極易受到細胞、霉菌、酵母菌的污染，一旦發酵液受到污染，由于產油微生物獲得營養物質的能力弱于雜菌、生長速度弱于雜菌，會出現細胞濃度生長停滯、胞內油脂含量下降等問題。

2 發酵過程染菌問題初探

搖瓶試驗與發酵罐中培養有較大的差別。 首先，發酵罐中培養時只能使用搖瓶接種或者上一級種子罐接種，為了減少生產成本， 種子罐的放大梯度一般僅為10 倍，因此接種量沒有辦法像搖瓶培養一樣達到20%甚至50%的接種量。 其次， 搖瓶中溶解氧的獲得主要依賴搖床搖動，使環境中氧氣溶解到培養基中。 而在室溫下物料的溶解氧數量比較有限， 因此搖瓶培養過程中圓紅冬孢酵母細胞獲得的溶解氧數量有限，影響了生長速度。 最后，搖瓶生長環境比較封閉，為了保證種子培養效果，搖床一般會放置到無塵室內， 因此圓紅冬孢酵母在培養過程中受到污染的概率極低。 為了探討圓紅冬孢酵母異養培養的生長特性， 本課題組先后進行了50 升小試和1500 升中試， 在發酵過程中，50 升小試和1500 升中試出現了一些不同的問題，針對這些問題本課題組做了初步分析，并提出了相應的解決方法。

2.1 50 升小試

按標準配方進行發酵， 出現了前期酵母細胞數增長較慢的現象，結果是較少的細胞濃度增殖速度較慢，并且在整體上拉長發酵周期，造成電、風的消耗增加。 針對這一現象分析原因可能是以下幾點。

一是發酵接種量稍低。 對于50 升發酵來說，初始培養基一般為30 升，接種500 毫升種子接種量低，僅有1/60，初始細胞濃度較低使發酵生長緩慢。 因此，為了縮短發酵周期需要提高接種量， 具體做法就是減小初始培養基的體積，以期在種子數量不變的情況下提高接種量。

二是發酵底料中初始糖濃度太高。 細胞接到發酵罐中以后需要有一個適應階段，因此出現了近16 小時的生長停滯期。 發酵初期圓紅冬孢酵母種群不占優勢，為了減少補料引起的染菌，減少補料次數，在發酵培養基里初始糖濃度比較高。 圓紅冬孢酵母種子在搖瓶中培養結束時糖含量基本為1%左右， 而到了發酵罐中糖含量高達10%，滲透壓的劇烈變化影響了產油酵母的正常生長。 解決的辦法就是降低發酵底料初始糖濃度， 將初始糖濃度降低到3%，然后將補料時間由第4 天提前到第2 天。 這樣做雖然在第2 天， 圓紅冬孢酵母細胞數量還沒有達到絕對優勢， 但是在對數生長期圓紅冬孢酵母細胞數量通常在10 億/毫升，而且增值迅速，能夠避免受到污染。

三是發酵中后期，干物質增加緩慢。 造成這種現象的原因主要是發酵底物濃度和發酵液體積增加過快， 圓紅冬孢酵母在生長過程中油脂積累速度較快， 因此為了維持正常的葡萄糖含量，每天需要補料1-2 升。 但是補料時使用的葡萄糖的濃度僅僅為50%左右， 不斷的補料造成發酵液體積增加，而發酵穩定期，圓紅冬孢酵母主要是積累胞內油脂數量，細胞增殖極慢。 補料體積增加較快、圓紅冬孢酵母酵母數量增加較慢， 導致補料相對稀釋了酵母細胞的數量。 解決的辦法是，減小初始培養基的體積，以騰出空間補料和提高初始的接種量。 另外，發酵底物中除氮源濃度以外，其他如碳源和微量元素等，胞內需要保持在一定的濃度， 以刺激產油酵母的細胞增殖和油脂生成。 關于補料，需要注意的是碳源在溶解過程中，水的添加以能溶解碳源為標準，不需要添加太多的水，否則會造成發酵液體積增長過快，終了干物質含量上不去。

2.2 1500 升中試

50 升發酵是介于實驗室研究和工業生產之間的階段，可以探討實驗室研究在工業生產中應用的不足，也可以尋找相應的解決方案。 但是50 升發酵是一個相對孤立的發酵過程，不能夠連續生產，因此仍然需要開展中試來進一步放大發酵試驗， 以發現發酵過程中有可能影響工業化的問題。

2.2.1 堿管堵塞

發酵過程中，出現過加堿系統不銹鋼管道堵塞現象。原因是： 為了保證發酵過程不染菌， 罐壓需要維持在0.1mpa 左右。 堿液濃度一般配40%， 接近溶解度的臨界點。 在流加的時候，如果風壓有波動，導致罐壓較高，堿液會在流加管中析出， 從而堵塞流加管。 或者外界溫度較低，堿液在較低的溶解度下析出顆粒狀物質，久而久之就會堵塞流加管道。

出現這種現象主要從兩方面解決， 一是盡量使用配好的堿液的上清部分，沉淀的雜質舍去不用。 批量采購的工業級氫氧化鈉中通常有一定的雜質， 在配成堿液并降溫至室溫后，會有一些不溶性物質析出，這些低溶解度的物質如果被蠕動泵堿流加壓到流加管中， 有可能在某些管道拐彎處沉積下來。 二是盡量使用30%左右濃度的堿液，這樣就會避免天氣溫度變化造成堿溶解度不同。 堿液濃度降低，會相應增加將pH 調節到正常水平所消耗的堿液體積，但是正常情況下，發酵過程中消耗堿液僅占總補料體積的十分之一，對整個發酵過程影響極小。 三是將罐壓降低到0.08mpa 左右， 罐壓的降低有可能增加染菌的機率，但是在保持正壓的條件下，染菌機率還是相對較低的。

2.2.2 染菌

染菌是發酵過程中一種比較普遍的現象。 出現染菌的原因主要有：風壓波動較大，引起進風口、排風口倒吸，補料過程操作不嚴謹帶入細菌。 染菌以后通常做法是立即高溫滅菌，并對環境反復消毒，這樣做結果是浪費前期投入的培養基、補料，以及過程中消耗的能源。 為了避免發生染菌現象， 綜合考慮1500 升每次出現的染菌時間，染菌后出現的現象，以及發酵平臺當時的其他操作等，我們大致總結出以下幾點注意事項。

一是，風系統中主渠道與分管道的配比是否合適，如果使用風的設備較多，主渠道就要相應粗一些，且單臺設備應當配置單獨的進風管道和排風管道， 這就不會導致單臺設備用風量較大時，其他設備風壓波動較大。 通常情況下，為了保持現場的美觀，在生產車間往往將多臺發酵罐的排風管道和進風管道合并在一起。 這種布局正常情況下不會出現問題， 但是如果出現風壓大幅波動或者風壓歸零的情況， 極有可能引起雜菌通過管道被倒吸進發酵罐中。 另外，多臺發酵罐的排風管道和進風管道合并在一起，也不利于在發酵罐實消階段徹底殺菌。

二是，風壓是否合適，不能太低，以免多個設備同時用風時造成風壓波動太大。 如果保持0.05mpa 以上的壓力，風壓即使保持波動也能維持在正壓的范圍內。 而罐壓低于0.05mpa，如果風壓波動較大，或者是空氣壓縮機、風管道出現問題，有可能使罐壓在某個時間段內為零，從而導致外界細菌進入到發酵罐內，造成污染。

三是，在前兩點的前提下，要注意操作其他設備對正在發酵的設備的風壓波動的影響。 在生產車間里，管道上的閥門比較大， 操作人員往往使用加力桿來開啟和關閉閥門，結果是閥門往往被快速開啟或關閉，引起其他用風管道的壓力大幅波動。 如果管道設置不當，再加上系統風壓劇烈波動，就會引起染菌。

四是，無論操作多么完善，也不可能比得上無塵室的環境，而且在無塵室中也會染菌。 因此在生產車間，要時刻防止染菌，在染菌以后應當及時挽救。 從目前的研究成果來看，可以通過添加青霉素等抑菌劑，破壞雜菌的細胞膜合成，抑制雜菌的生長。 而產油酵母的生長雖然不能和正常發酵過程相媲美， 但是仍然能夠達到一個較高的水平，從而減少因為染菌而造成的物料和能源消耗。 課題組在染菌后加入500ppm 的青霉素取得了較好的效果，能夠保證實驗順利進行下去。

3 結論

微生物發酵法制備生物柴油原料具有較多優勢，是生物能源領域重要的組成部分，但是作為一種新生事物，還需要不斷完善。 生產企業應不斷完善生產系統，以滿足產油微生物生長的需求。 研究人員需要不斷嘗試，篩選新的菌株、開發更貼近生產應用的原料，還需要開發新的工藝以提高生產效率、降低成本，使微生物發酵制備生物柴油早日實現工業化。

［1］畢生雷，張成明，李十中，等.異養小球藻半連續發酵生產油脂工藝探討［J］.食品與發酵科技，2014（05）:36-40.

［2］畢生雷，喬建援，劉鉞，等.異養小球藻用發酵罐的使用與維護［J］.化學工程與裝備，2014（07）:64-65.

［3］馬勇，圖雅，劉曉光等.產油酵母菌高產培養基的營養成分優化［J］.湖北農業科學，2013，52（23）:5832-5835.