乳酸鏈球菌素分離純化研究進展

左愛輝 孫遠功 劉鑫峰

（洛陽奇泓生物科技有限公司，河南洛陽 471041）

乳酸鏈球菌素分離純化研究進展

左愛輝 孫遠功 劉鑫峰

（洛陽奇泓生物科技有限公司，河南洛陽 471041）

當今市場上的乳酸鏈球菌素純度較低，限制了其應用前景。Nisin作為新型的高效、無毒、安全的天然食品防腐劑，進入人體后分解為人體可吸收的氨基酸，且不影響腸道菌群的正常活動。此外，Nisin在醫療衛生領域也有很大的應用前景。通過對Nisin常用分離純化技術優缺點的分析，并總結前人在Nisin分離純化方面的研究，為后續研究者提供一些理論參考。

乳酸鏈球菌素；鹽析法；層析技術；HPLC

乳酸鏈球菌素（NinhibiforySubstance，Nisin）也叫乳酸鏈球菌肽或尼生素，是從鏈球菌屬的乳酸鏈球菌發酵產物中提取的一類多肽化合物。Nisin作為新型的高效、無毒、安全的天然食品防腐劑，進入人體后被機體蛋白酶消化分解為氨基酸，被機體吸收利用，并且不影響腸道內正常菌群的生命活動，是當今食品行業中保鮮防腐，延長貨架期的絕對良品。除此之外，Nisin在醫療衛生領域也有很大的應用前景，高純度的Nisin對治療母牛乳腺炎有很好的療效［1］。然而，當今市售的Nisin純度較低，且含有較多的雜蛋白，進入機體后會引起一些不良反應，影響了其在醫療領域的應用和推廣。因此，如何獲取高純度的Nisin是未來研究者應著重努力的重點。

本文就當前科研和生產領域主要用到的分離純化技術做簡要陳述，并對其在乳酸鏈球菌素提取領域的應用現狀進行分析，以期為今后獲取高純度的Nisin提出一些理論參考。

1 Nisin分離純化技術

1.1 常用分離方法

目前乳酸鏈球菌素的常用分離純化方法主要有：有機溶劑法、鹽析法、菌體吸附法、樹脂吸附法、泡沫分離法等。

1.1.1 有機溶劑法。有機溶劑法也稱為正丙醇法，其利用有機溶劑沉淀Nisin，利用KH2PO4等進行鹽析，反復沉淀后溶解（主要溶劑為正丙醇）得到乳酸鏈球菌素的粗品。該方法的缺點是不能充分沉淀，而且有機溶劑殘余對Nisin應用有很大影響。魯吉珂等［2］在試驗中以有機溶劑三氯甲烷和正丁醇配合使用的方法，從發酵濃縮液中提取出乳酸鏈球菌素，正丁醇和三氯甲烷體積比1:1組成的復合溶劑，提取效果優于單一的有機溶劑。

1.1.2 鹽析法。蛋白質分子在低鹽濃度下的溶解度隨著鹽溶液濃度升高而增加，稱為鹽溶；當鹽濃度不斷上升時，蛋白質的溶解度又因溶解度下降而先后析出，稱為鹽析。乳酸鏈球菌素采用鹽析法提取的過程中，用硫酸銨沉淀得到Nisin粗品，回收率相對較高，且所得Nisin產品活性損失較少。該方法缺點也非常明顯，在鹽析過程中，發酵液中的其他蛋白類物質也隨之沉淀，導致Nisin成品純度偏低。同時廢水中的硫酸銨對環境污染嚴重，增加環保壓力。

1.1.3 菌體吸附法。菌體吸附法通過調節pH使乳酸鏈球菌選擇性的吸附、釋放乳酸鏈球菌素。葉嗣穎等［3］通過pH吸附法，利用乳酸鏈球菌亞種研究了NisinZ分子在不同pH環境下的吸附作用及其分離純化效率，并采用SDS-PAGE和RP-HPLC進行純度鑒定，證實用此技術分離NisinZ具有高效、高純度、操作簡便等良好特性，但此法也存在著損失率偏高的問題。

1.1.4 樹脂吸附法。樹脂吸附法原理是乳酸鏈球菌素在一定條件下可以與某些樹脂發生特異性吸附，改變條件后吸附減弱，乳酸鏈球菌素可被洗脫下來。大孔吸附樹脂是一類具有大孔結構的非離子型高分子化合物，具有吸附和篩選功能，且容易再生，在分離純化蛋白質時具有條件溫和、設備簡單和操作方便的特點［4］。王暉等［5］采用大孔吸附樹脂分離發酵液中的乳鏈菌肽，確定了兩種樹脂D3520、D4020對乳鏈菌肽靜態、動態吸附及靜態解吸的最優化操作條件。與其他分離純化方法相比，用大孔樹脂分離純化的方法簡便易行、分離純度高、安全無毒害，是一種有效地分離手段。

1.1.5 泡沫分離法。泡沫分離法主要采用鼓泡塔間歇分離，然后用無機鹽鹽析、噴霧干燥，制成食品級乳酸鏈球菌素粉末。生產中采用泡沫分離法受多種因素的影響，包括溶液pH值、表面活性劑性質、泡沫的性質、排沫方式、攪拌等。

1.2 層析色譜技術

層析色譜技術根據分離物質和固定相間作用力的不同，可分為凝膠過濾層析、離子交換層析、反相層析、親和層析、親核膜分離技術、高效液相色譜法等諸多方法。

1.2.1 凝膠過濾層析。凝膠過濾層析根據被分離物質分子量差異而進行分離。當含有不同大小的混合物樣品加入到凝膠色譜柱中，隨著洗脫液的流動，分子質量最大的物質因不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，分子量最小的物質因能進入凝膠網孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出色譜柱，從而使混合物樣品中不同分子量的物質得以分離。該方法設備要求簡單，操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果，因此被生物化學、分子生物學、生物工程以及醫藥學等領域廣泛應用［6］。吳紅艷等［7］采用凝膠層析對乳酸菌粗提液進行分離、純化，得到乳酸菌肽純化樣品，并對其含量、純度及抑菌效果等指標進行了測定，得出純化時間在14～18h所收集的樣品含量最高、純度最高、抑菌效果最好。從而獲得了重要的乳酸菌肽研究資料，為今后更進一步的研究打下基礎。

1.2.2 離子交換層析。離子交換層析以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動相，使不同溶質按照其離子交換親和力的不同而得到分離的方法。Nisin由34個氨基酸組成，同時具有疏水性和親水性結構，其在不同的pH溶液中帶有不同的電荷，因此可以通過離子交換層析法進行分離純化。

1.2.3 反相層析。反相層析是利用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據溶質極性（疏水性）的差別進行溶質分離純化的層析方法。其固定相表面完全被非極性集團所覆蓋，表現出強烈的疏水性。反相層析介質性能穩定，分離效率高，主要應用于分子量5000以下的小分子物質分析。

1.2.4 親和層析。親和層析是利用偶聯親和配基的親和吸附介質為固定相來吸附目標產物，使其得到分離純化的液相層析法。親和層析法只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，達到千倍以上的純化效果并保持較高的生物學活性。親和層析法步驟簡單，純化時間短，非常有利于不穩定蛋白的純化。目前親和層析技術被廣泛地應用于蛋白質的研究和制備領域，是分離純化以及分析生物大分子（尤其是蛋白質）的有力工具［8］。

1.2.5 親和膜分離。親和膜分離是將親和分離技術和膜分離技術結合，將親和配基結合在分離膜上，利用膜作為基質，對膜進行改性，再按照吸附、清洗、洗脫和再生的過程，對生物產品進行分離純化。親和膜分離具有親和分離技術的高選擇性，同時親和配基固定在膜載體上，傳質阻力大大減小，便于連續、自動化操作，適用于工業化生產。在上述親和層析介質制備的基礎上，采用相同的親和配基，選擇合適的親和膜載體，對載體活化及膜分離過程進行優化和放大，從而建立工業化規模層析裝置。

1.2.6 高效液相色譜法。

高效液相色譜法（High PerformanceLiquidChromatography，簡稱HPLC）是一種高效快速分離化合物的方法，由于其靈敏度高，重復性好，分析速度快，應用范圍廣等特點，近年來在生物大分子的分離和純化方面占據了極其重要的地位。此外高效液相色譜還具有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點。它能有效地分離各種多肽混合物，特別適用于分子質量不大的蛋白質及多肽物質的分離、純化和鑒定，在蛋白質及多肽研究中得到了廣泛的應用。其中反相高效液相色譜（RPLC）被廣泛應用于分子質量不大的蛋白質分離、純化和鑒定上［8］。

1.3 凝膠電泳

凝膠電泳主要包括SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和雙向電泳。這兩種研究方法主要應用于蛋白質分子量大小的定量研究。

1.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳是由丙烯酰胺和交聯劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑（過硫酸銨和四甲基乙二胺）作用下，聚合交聯成網狀立體結構的凝膠，并以此為支持物進行電泳。在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS后，其掩蓋了蛋白質分子間電荷的差異，僅僅由蛋白質分子量大小決定其在凝膠中的遷移率。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）具有很高的靈敏度和準確性，是目前實驗室檢測蛋白質分離樣品純度常用的分析技術。

1.3.2 雙向電泳。雙向電泳技術是蛋白質組學研究的核心技術，主要由等電聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳復合而成，第一向進行等電點聚焦，蛋白質分子沿pH梯度進行分離，到達各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離。該技術能夠把混合液中每個不同的蛋白質分子分離開來，由于操作復雜，價格昂貴，目前只適用于實驗室研究。

2 層析技術和HPLC等在Nisin分離純化中的運用

通常情況下，如果試驗中需要相當純度的抗菌肽，需要綜合運用多種方法才能得到所需的產物。

李增利［9］研究認為，Nisin的電荷性和疏水性使其易從含有高濃度多肽的發酵液中分離出來。實驗室純化Nisin的程序一般包括硫酸銨鹽析、離子交換色譜、疏水作用色譜和反相高效液相色譜多種純化步驟；也可用等電聚焦電泳替代色譜分離法純化Nisin，或采用免疫親和色譜分離法一步純化Nisin。盡管這些方法均具有很好的效果，但并不適合Nisin的大規模生產應用。

目前已經開發出一些基于吸附-解析或者相分配原理大規模回收和純化Nisin的有效方法：如調節發酵液pH至6.0～6.5時，使Nisin吸附于產生菌細胞上，然后進行細胞分離，并在pH2.0和0.1mol/LNaCl條件下進行解吸而回收分離Nisin；不過當發酵液中Nisin濃度過高時，將會超過菌體細胞吸附Nisin的能力，影響Nisin的回收率。

杜琨等［10］采用分離、凝膠層析、抑菌實驗、高效液相色譜法，來純化從高原酸奶中提取的乳酸鏈球菌產生的乳酸鏈球菌素，得到了純度較高的乳酸鏈球菌素。

盛博文［11］在研究中聯合使用10k超濾管離心、SephadexG-25凝膠過濾、離子交換層析、制備型以及分析型反相高效液相色譜等方法，對乳酸鏈球菌發酵液進行分步分離和純化，得到了純品NisinP。其研究方法為生產Nisin提供很高的參考價值。

3 展望

隨著人們生活水平的提高和綠色保健食品觀念的增強，在食品中添加純天然防腐劑的研究和應用越來越受到人們的重視和關注。Nisin作為一種高效、無毒的純天然食品添加劑完全符合未來食品防腐劑的要求［12］。生產中如何獲得高純度的Nisin產品，使其在食品和醫療領域能夠廣泛應用，是我們研究者面臨的主要難題。

層析技術和凝膠電泳作為現代分離技術的核心技術，在單一技術不能解決問題的情況下，如何通過兩種功能互補的技術相結合而達到我們預期目的是我們亟待解決的問題。本文通過對Nisin分離純化技術的總結，整理前人的研究成果，能夠為后續研究者提供一些理論參考。

［1］吳俊強，曹立亭，胡松華.乳酸鏈球菌素治療奶牛乳房炎效果觀察［C］.獸醫臨床學術年會，2008：397-400.

［2］魯吉珂，黎業娟，吳霄玥，等.有機溶劑沉淀法提取乳酸鏈球菌素的效果［J］.食品科學，2012，33（10）：84-86.

［3］葉嗣穎，謝昕，黃慶華，等.乳鏈菌肽NisinZ的pH吸附法分離純化技術研究［J］.同濟醫科大學學報，2000，29（2）：124-126.

［4］趙利，錢芳，許建軍，等.大孔吸附樹脂及其在蛋白質、多肽和氨基酸分離純化中的應用［J］.四川食品與發酵，2003，39（2）：39-41.

［5］王暉，胡濱，吳兆亮，等.大孔吸附樹脂分離發酵液中乳鏈菌肽的工藝研究［J］.中國抗生素雜志，2007，32（9）：572-574.

［6］楊安鋼，毛積芳，藥立波，等.生物化學與分子生物學實驗技術［M］.北京：高等教育出版社，2001：14-18.

［7］吳紅艷，陳飛，桓明輝，等.乳酸菌肽分離純化研究［J］.微生物學雜志，2006，26（2）：104-106.

［8］牛瑞，秦勝利.蛋白質分離純化技術研究進展［J］.化工科技市場，2010，33（4）：16-18.

［9］李增利.Nisin的生產、提純和檢測［J］.中國食品添加劑，2004，4：64-68.

［10］杜琨，陳錦屏，蘇鳳賢，等.高原酸奶中乳酸鏈球菌產生的乳酸鏈球菌素純化鑒定研究［J］.食品工業科技，2012，7：169-171.

［11］盛博文，楊海君，關向杰.乳酸鏈球菌抗菌肽的分離純化及生物活性檢測［J］.湖南農業科學，2010，11：17-19.

［12］李東，趙春燕.乳酸鏈球菌素的研究進展［J］.食品科技，2006，1：75-78.

The Research Progress of Separation and Purification of Nisin

Zuo Aihui Sun Yuangong Liu Xinfeng
(Luoyang ChiHon Biotechnology Co.，Ltd，Luoyang Henan，471041)

The low purity of Nisin on the present market limits its application prospects. Nisin, as a new highlyefficient, non-toxic, safe natural food preservative, decomposes into the amino acids that can be absorbed in humanbody, and does not affect the normal activities of the intestinal flora. In addition, Nisin also has great prospects in thehealth field. We provide some theoretical reference for subsequent researchers in the article through the analysis ofthe advantages and disadvantages of the commonly used separation and purification technology of Nisin andsummarizing previous studies on separation and purification of Nisin.

Nisin；salting out method；chromatographic technique；HPLC

Q936

：A

：1003-5168（2015）03-0134-3

2015-2-19

左愛輝（1986-），男，碩士研究生，研究方向：微生物工藝研究。