高脂飲食誘導的C57BL/6J幼鼠腎足細胞中Synaptopodin的表達及意義

沈 健，臧東鈺，李曉明

遼寧醫學院 組織胚胎學教研室，遼寧錦州 121001；2遼寧醫學院附屬第三醫院 胸外科，遼寧錦州121001

高脂飲食誘導的C57BL/6J幼鼠腎足細胞中Synaptopodin的表達及意義

沈 健1，臧東鈺2，李曉明1

遼寧醫學院 組織胚胎學教研室，遼寧錦州 121001；2遼寧醫學院附屬第三醫院 胸外科，遼寧錦州121001

目的 探討足細胞骨架蛋白Synaptopodin在高脂飲食所致腎發育期足細胞損傷中的表達及意義。方法 32只3周齡雄性C57BL/6J幼鼠隨機分為正常飲食組和高脂飲食組，分別給予標準飼料與高脂飼料喂養4周。檢測葡萄糖耐量水平、尿微量白蛋白與尿肌酐；觀察小鼠腎的病理形態學改變，應用免疫組織化學和免疫印跡技術檢測小鼠腎足細胞中Synaptopodin的表達變化。結果 與正常飲食組相比，高脂飲食組小鼠體質量顯著增加，葡萄糖調節受損，尿微量白蛋白與尿肌酐比率增高。鏡下可見腎小球肥大，腎小囊腔內滲出，系膜基質輕度增生等病理改變。同時足細胞Synaptopodin的表達明顯降低。結論 Synaptopodin在高脂飲食誘導的C57BL/6J幼鼠腎足細胞中表達顯著降低，并出現蛋白尿。

高脂飲食；足細胞；突觸足蛋白；免疫組化；免疫印跡

兒童期肥胖會增加腎疾病的發病率，并且在出現高血壓或糖尿病之前就已出現腎功能障礙[1-2]。高脂飲食會引起肥胖并導致體內脂質和葡萄糖代謝紊亂[3]。而脂質和葡萄糖代謝紊亂是許多原發和繼發性腎疾病發生、發展的的關鍵環節[4-5]。因此，闡明高脂飲食對發育期腎損傷的影響及機制具有重要意義。本研究采用免疫組織化學技術及免疫印跡技術觀察高脂飲食對C57BL/6J幼鼠腎功能、腎組織形態學以及腎足細胞骨架蛋白Synaptopodin表達的影響，探討Synaptopodin在高脂飲食所致腎發育期足細胞損傷中的作用及意義，為進一步闡明高脂飲食所致腎損害的發病機制提供實驗依據。

材料和方法

1動物飼養 3周齡雄性C57BL/6J小鼠32只，將小鼠隨機分為正常飲食組(n=16)和高脂飲食組(n=16)。正常飲食組給予標準飼料，高脂飲食組給予高脂飼料，飼料均購自美國Research Diets公司，喂養4周。各組小鼠分別于飼養0周、1周、2周、3周和4周時稱量體質量。飼養4周后進行葡萄糖耐量實驗，并收集尿液用于測定尿白蛋白與尿肌酐。

2葡萄糖耐量實驗 實驗前將小鼠禁食16 h，稱重，腹腔注射葡萄糖溶液(2 mg/g)，分別在注射葡萄糖后即刻、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min尾部取血，用血糖儀檢測血糖水平。

3ELISA試劑盒檢測尿微量白蛋白與尿肌酐 收集尿液，離心后收集上清。空白孔加樣品稀釋液50μl，余孔分別加標準品及待測樣品50μl，室溫孵育120 min。加酶標試劑50μl，室溫孵育60 min。加50μl 1×SP conjugate，室溫孵育30 min。加顯色劑至出現明顯的梯度藍色，待標準孔由藍色轉變成黃色，加終止液終止反應。用酶標儀在450 nm波長下依序測量各孔的光密度(OD值)。

4免疫組織化學染色 各組小鼠飼養4周后，麻醉(2%戊巴比妥腹腔注射)，4%多聚甲醛行心臟灌流，取腎。右腎入-80℃冰箱中保存。左腎入4%多聚甲醛固定液固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片5μm。石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育10 min，枸櫞酸鹽高壓修復，正常山羊血清封閉。滴加兔多克隆抗體Synaptopodin(1∶200)，4℃過夜，滴加HRP抗兔IgG 37℃孵育。DAB顯色，復染，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作陰性對照。光學顯微鏡下觀察并攝片。Synaptopodin蛋白表達在細胞質，以出現黃色或棕黃色的細小顆粒著色為陽性。

5Western blotting測定 取腎組織剪碎，加入裂解液，離心，取上清。灌膠，加樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，兔多克隆抗體Synaptopodin(1∶500)，4℃過夜。二抗室溫孵育，ECL顯色。應用FluorchemⅤ2.0系統進行光密度測。Synaptopodin蛋白的分子量為74 kU，以目的條帶與內參照GAPDH平均吸光度的比值表示蛋白水平，進行半定量分析。

6統計學處理 應用SPSS17.0軟件進行統計分析，實驗數據用-x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1高脂飲食對小鼠體質量的影響 將3周齡的幼鼠分組喂養4周后，可見高脂飲食組小鼠體型偏胖，體毛光澤，其體質量較正常飲食組明顯增加(P＜0.05)。見表1。

2葡萄糖耐量實驗 高脂飲食組小鼠葡萄糖負荷在各時間點的血糖水平明顯高于正常飲食組(P＜0.05)，而且血糖下降水平較為緩慢，表明高脂飲食小鼠喂養4周后葡萄糖調節受損。見圖1。

3小鼠尿微量白蛋白/尿肌酐比率 高脂飲食組小鼠的尿微量白蛋白/尿肌酐比率(albumin/creatinine ratio，ACR)明顯高于正常飲食組。見圖2。

4小鼠腎病理形態學 與正常飲食組相比，高脂飲食組小鼠腎組織出現了腎小球肥大，腎小囊腔內可見滲出，系膜基質輕度增生等病理改變。見圖3。

5免疫組化染色 正常飲食組小鼠腎足細胞中Synaptopodin表達較強(圖4)。高脂飲食組小鼠腎足細胞中，Synaptopodin的表達明顯減弱。見圖5。

6免疫印跡結果 與正常飲食組相比，高脂飲食組Synaptopodin蛋白的表達水平明顯下降。見圖6。

圖 1 高脂飲食組和正常飲食組小鼠葡萄糖耐量實驗Fig. 1 Glucose tolerance test of high-fat diet group and normal diet group

圖 2 高脂飲食組和正常飲食組小鼠尿微量白蛋白/尿肌酐比率Fig. 2 Ratio of albumin/creatinine of high-fat diet group and normal diet group

表1 正常飲食組和高脂飲食組小鼠體質量比較Tab. 1 Body weight of normal diet and high-fat diet group ()

表1 正常飲食組和高脂飲食組小鼠體質量比較Tab. 1 Body weight of normal diet and high-fat diet group ()

aP＜0.05, vs normal diet group

Group (n=16)0 week1st week2nd week3rd week4th week Normal diet10.78±1.3415.86±0.8118.94±1.1221.31±0.8523.60±1.21 High-fat diet10.86±0.8418.39±1.2623.09±1.05a26.49±1.18a28.58±1.07a

圖 3 高脂飲食組小鼠腎HE染色(×1 000)Fig. 3 HE staining in kidney of highfat diet mice (×1 000)

圖 4 正常飲食組小鼠腎Synaptopodin免疫組化染色 (×1 000)Fig. 4 Expression of Synaptopodin in kidneys of normal diet mice by immunohistochemistry (×1 000)

圖 5 高脂飲食組小鼠腎Synaptopodin免疫組化染色 (×1 000)Fig. 5 Expression of Synaptopodin in kidneys of high-fat diet mice by immunohistochemistry (×1 000)

圖 6 正常飲食組和高脂飲食組小鼠Synaptopodin蛋白的免疫印跡分析結果A:免疫印跡電泳圖； B: Synaptopodin表達水平Fig. 6 Western blotting analysis of Synaptopodin in kidneys of normal diet and high-fat diet mice A: Electrophoretogram of western blotting; B: Expression level of Synaptopodin

討 論

足細胞又稱腎小球臟層上皮細胞，是一種高度特異性的終末分化細胞，其足突相互交錯覆蓋于腎小球基底膜最外側，是腎小球濾過膜的最后一道屏障[6]。足細胞損傷與其骨架蛋白的異常表達密切相關。足細胞骨架蛋白表達異常會導致足細胞穩定性降低、細胞間信號傳導障礙及濾過屏障破壞，從而引起蛋白尿及腎功能損害[7-8]。足細胞骨架蛋白主要包括肌動蛋白(actin)、α-actinin-4和Synaptopodin等[9]。Synaptopodin是一種富含脯氨酸的線狀蛋白，只表達在腎小球內分化成熟的足細胞和后腦的突觸內[10]。研究顯示，Synaptopodin在腎足細胞的結構和動力學等方面發揮著重要作用[11]。但是目前關于Synaptopodin在高脂飲食誘導的腎發育期足細胞損傷中的作用及意義尚不清楚。

小鼠腎小體于胚齡14 d發生，生后6周達到成年水平。因此本實驗以高脂飲食喂養3周齡雄性C57BL/6J幼鼠4周，觀察高脂飲食對幼鼠體質量、葡萄糖耐受水平、發育期腎組織形態學以及腎功能的影響。結果顯示，高脂飲食喂養4周后，小鼠體質量增長幅度較正常飲食組小鼠明顯提高，同時出現了葡萄糖耐量受損，說明高脂飲食小鼠出現了肥胖和代謝紊亂的癥狀。Sanad和Gharib[12]對150位肥胖患兒進行研究，發現14.7%的患兒出現了微量白蛋白尿，提示肥胖是微量白蛋白尿的重要危險因素。我們的實驗結果顯示，高脂飲食小鼠出現了尿微量白蛋白排泄率增高。微量白蛋白尿的出現是腎功能受損最敏感的標志，因此提示小鼠腎功能已經處于早期損傷的階段。此外，HE染色結果顯示，高脂飲食組小鼠出現腎小球肥大、腎小囊腔內滲出以及系膜基質輕度增生等表現。高脂飲食組小鼠腎小球病理結構的改變與蛋白尿的發生發展密切相關。我們的研究提示，高脂飲食誘導發育期C57BL/6J小鼠出現了代謝紊亂、腎小球病理改變以及腎功能輕度受損。

足細胞骨架蛋白Synaptopodin是成熟足細胞的特異性標記物。Synaptopodin與足突的肌動蛋白微絲緊密相連，并與肌動蛋白一同導致足突結構和功能的改變[13-14]。體外培養實驗發現，Synaptopodin基因缺失的足細胞會形成異常的非極性層狀偽足，導致細胞遷移受損[15]。Yanagida-Asanuma等[16]認為，Synaptopodin通過將足細胞從運動型轉化為收縮型來維持腎小球濾過功能的穩定。在本實驗中，我們通過免疫組化及免疫印跡技術檢測了Synaptopodin在高脂飲食誘導的腎足細胞中的表達變化。結果顯示，與正常飲食組相比高脂飲食組小鼠腎足細胞Synaptopodin表達顯著降低。足細胞損傷與蛋白尿的發生發展密切相關。足細胞的損傷和丟失會嚴重破壞腎小球濾過屏障的完整性，促使腎功能發生損害[17-18]。

綜上所述，高脂飲食誘導的C57BL/6J幼鼠腎足細胞Synaptopodin的表達發生了變化，即表達顯著降低。足細胞骨架蛋白Synaptopodin異常表達可能對足細胞結構及功能的穩定性產生影響，可能導致足細胞損傷，繼而引起腎功能損害。但其具體的調控機制仍有待深入研究和探討。

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Expression of Synaptopodin in podocytes of high-fat diet C57BL/6J young mice

SHEN Jian1, ZANG Dongyu2, LI Xiaoming1
Department of Histology and Embryology, Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Department of Thoracic Surgery, the Third Affliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

LI Xiaoming. Email: lixiaoming68327@163.com

Objective To investigate the expression and signifcance of Synaptopodin resulting in podocyte injury in high-fat diet C57BL/6J mice. Methods Thirty-two male C57BL/6J mice were randomly divided into two groups. The standard group was fed with basic diet and high-fat diet group was fed with high-fat diet for 4 weeks. Body weight and urine protein changes were measured. nsulin resistance was detected by glucose tolerance test. The kidney tissue morphological changes were examined by HE staining. The expression of Synaptopodin was examined by immunohistochemistry and western blotting. Results In high-fat diet group, the body weight was higher than the standard group, and there was signifcant decrease in glucose tolerance levels and rise in urinary lbumin/ creatinine ratio. HE staining results showed that there were glomeruli hypertrophy, mesangial matrix hyperplasia, and glomerulosclerosis. Compared with standard group, the expression of Synaptopodin in high-fat diet group reduced signifcantly in odocyte. Conclusion The expression of Synaptopodin in podocyte of high-fat diet C57BL/6J mice reduces signifcantly, which may ead to proteinuria.

high-fat diet; podocyte; synaptopodin; immunohistochemistry; western blotting

R 587

A

2095-5227(2015)09-0940-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.09.022

時間：2015-06-15 15:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150615.1539.001.html

2015-04-08

遼寧省高等學校優秀人才支持項目(LJQ2013092)；遼寧醫學院校長基金項目(XZJJ20130243)

Supported by the Program for Liaoning Excellent Talent in University(LJQ 2013092)

沈健，男，碩士，主治醫師。研究方向：腎發育與疾病。Email: 12090337@qq.com

李曉明，女，博士，教授。Email: lixiaoming68327@163. com