丹酚酸B對金黃色葡萄球菌肺炎幼年小鼠肺組織修復及腦神經保護作用的觀察

李建成，馮 斌

1)駐馬店市中心醫院重癥醫學科 河南駐馬店 463000 2)河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科 鄭州 450003

肺炎是兒童常見的呼吸系統疾病之一，且以金黃色葡萄球菌等細菌性及病毒性肺炎較為多見[1]，同時，由于兒童免疫系統發育尚未成熟，如果肺炎治療不及時，疾病可能進展為細菌性腦膜炎等，造成肺組織及腦神經損傷，甚至造成患兒死亡[2]。丹酚酸B是從傳統中藥材丹參中提取得到的活性成分，近年來研究[3-4]表明，丹酚酸B具有抗炎、神經保護等多種藥理作用。本文通過研究丹酚酸B對金黃色葡萄球菌肺炎幼年小鼠(幼鼠)肺組織修復及腦神經保護的作用及機制，為丹酚酸B在肺炎患兒中的臨床應用提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器丹酚酸B購自上海源葉生物科技有限公司；SOD活性檢測試劑盒及MDA檢測試劑盒,TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA檢測試劑盒，離子鈣接頭分子(Iba-1)、p-NF-κBp65、NF-κBp65及GAPDH抗體，免疫熒光染色試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌菌株(編號ATCC4300)購自美國ATCC；ECLIPSETS100-F 倒置顯微鏡購自日本 Nikon 公司；MRZ14M010高速冷凍離心機購自美國Beckman公司；SpectraMax190多功能酶標儀購自上海美谷分子儀器有限公司；ChemiDoc XRS凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；BX50/BX-FLA/DP70型光學/熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；UniCel DxC 800 Synchron全自動生化分析儀購自貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司。

1.2動物分組及處理健康雄性C57BL/6幼鼠125只，購自河南省實驗動物中心，4～6周齡，動物房溫度(22±2) ℃，濕度(50±10)%，適應性喂養1周，除25只幼鼠作為對照組外，其余100只幼鼠參照文獻[5]方法建立金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠模型。7.5 g/L的戊巴比妥鈉腹腔注射對幼鼠進行麻醉后，使用移液槍取金黃色葡萄球菌菌液10 μL(1×1010CFU/mL)緩慢滴入幼鼠鼻腔，使幼鼠與操作臺成45°角保持1 min，1次/d，連續3 d，以幼鼠出現呼吸急促、活動量減少及肺組織病理改變視為造模成功。100只均造模成功。將造模成功的幼鼠分為4組，每組25只，分別為模型組、丹酚酸B低劑量組、丹酚酸B中劑量組、丹酚酸B高劑量組。丹酚酸B低、中、高劑量組分別按照5、10、20 mg/kg腹腔注射丹酚酸B[6-7]，對照組及模型組腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，連續7 d[5-6]。

1.3各組幼鼠動脈氧分壓(PaO2)、氧合指數(OI)的測定各組幼鼠最后一次給藥24 h后，每組取10只幼鼠，7.5 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，自左心室采血2 mL，采用血氣分析儀檢測PaO2、OI。

1.4各組幼鼠肺組織濕干重比值(W/D)的測定每組取10只幼鼠，頸椎脫臼法處死幼鼠后迅速分離幼鼠肺組織，并用濾紙吸干水分后置于玻璃試管中稱重，然后置于烘箱中，80 ℃烘烤24 h至恒重后，計算各組幼鼠肺組織W/D。W/D=幼鼠肺組織濕重(mg)/幼鼠肺組織干重(mg)。

1.5各組幼鼠學習記憶能力的測定利用Morris水迷宮，對各組幼鼠進行定位巡航實驗和空間探索實驗。每組取15只幼鼠，將幼鼠放入水槽自由游泳2 min，適應迷宮內、外環境及游泳狀態，持續訓練3 d，2次/d。于第4天進行定位巡航實驗，幼鼠從4個不同的標記點分別入水，記錄其自入水到爬上平臺所需要的時間，記為逃避潛伏期；如果幼鼠在90 s內未找到平臺，則將其引導至平臺休息10 s，逃避潛伏期記為90 s。定位巡航實驗結束后進行空間探索實驗：撤出平臺，將幼鼠放入水中自由游泳，記錄首次穿過平臺所在象限需要的時間以及在90 s內穿過平臺的次數。采用Morris水迷宮圖像自動監視處理系統測定逃避潛伏期、首次穿過平臺時間、90 s內穿過平臺次數。

1.6各組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的測定水迷宮實驗結束后，每組取15只幼鼠摘除眼球取血至干凈離心管中，于4 ℃靜置4 h，然后置于離心機中4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測幼鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.7各組幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平的測定每組取15只幼鼠，取肺組織，用4 ℃預冷的生理鹽水洗去表面血液后，用濾紙吸干表面水分，按照試劑盒說明書檢測幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平。

1.8各組幼鼠肺組織病理學檢查每組取15只幼鼠，處死后取肺組織，在體積分數10%中性甲醛中固定后脫水、石蠟包埋，5 μm厚切片，常規HE染色，顯微鏡下進行病理學觀察。

1.9各組幼鼠肺組織中NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的檢測每組取15只幼鼠，取肺組織裂解后提取總蛋白，蛋白定量后，取等量蛋白進行電泳分離、轉膜，經NF-κBp65、p-NF-κBp65及內參GAPDH抗體(均1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，應用Image J圖像分析系統測定條帶灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.10各組幼鼠腦組織中Iba-1蛋白的免疫熒光染色每組取15只幼鼠腦組織制作石蠟切片，體積分數5%胎牛血清封閉后，滴加Iba-1一抗 (1∶200稀釋)，4 ℃過夜，依次經山羊抗兔二抗(1∶500稀釋)室溫下孵育50 min，CY3孵育10 min，經含吐溫磷酸鹽緩沖液洗滌3次，滴加抗熒光淬火封片液，孵育5 min，DAPI染色10 min后使用熒光顯微鏡觀察，利用Image Pro Plus 6.0合成Merge圖，Image J圖像分析系統分析平均熒光強度，即蛋白的表達水平。平均熒光強度=區域熒光強度總和/區域面積。

1.11統計學處理應用SPSS 19.0對數據進行分析。5組幼鼠W/D、PaO2、OI，逃避潛伏期、首次穿過平臺時間、90 s內穿過平臺次數，血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，肺組織SOD活性、MDA水平，肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白表達水平及p-NF-κBp65/NF-κBp65比值，腦組織Iba-1蛋白表達水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.15組幼鼠肺組織W/D、PaO2、OI的比較結果見表1。由表1可知，與對照組相比，模型組幼鼠肺組織W/D升高，PaO2、OI降低；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺組織W/D降低，PaO2、OI升高，隨劑量升高，各指標改善更為顯著。

表1 5組幼鼠肺組織W/D、PaO2、OI的比較

2.25組幼鼠學習記憶能力的比較結果見表2。由表2可知，與對照組相比，模型組幼鼠逃避潛伏期及首次穿過平臺時間延長，90 s內穿過平臺次數減少；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠逃避潛伏期及首次穿過平臺時間縮短，90 s內穿過平臺次數增加，隨劑量升高，各指標改善更為顯著。

表2 5組幼鼠逃避潛伏期、首次穿過平臺時間、90 s內穿過平臺次數的比較

2.35組幼鼠血清炎癥因子水平的比較結果見表3。由表3可知，與對照組相比，模型組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低，隨劑量升高，3種炎癥因子水平降低更為顯著。

表3 5組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的比較 ng/L

2.45組幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平的比較結果見表4。由表4可知，與對照組相比，模型組幼鼠肺組織SOD活性降低，MDA水平升高；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺組織SOD活性升高，MDA水平降低，隨劑量升高，各指標改善更為顯著。

表4 5組幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平的比較

2.55組幼鼠肺組織病理學觀察結果見圖1。與對照組相比，模型組幼鼠肺泡邊緣不整齊，間質水腫，可見大量炎性細胞浸潤，支氣管上皮細胞壞死，腔內有大量的炎性細胞，血管周圍水腫，提示造模成功；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺泡邊緣結構明顯改善，丹酚酸B低、中劑量組幼鼠肺間質水腫及支氣管上皮細胞壞死明顯減輕，少見炎性細胞浸潤，丹酚酸B高劑量組幼鼠肺組織病理學明顯改善，偶見炎性細胞浸潤，少見支氣管上皮細胞壞死。

A:對照組；B:模型組；C:丹酚酸B低劑量組；D:丹酚酸B中劑量組；E:丹酚酸B高劑量組

2.65組幼鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65及腦組織Iba-1水平的比較結果見圖2、3及表5?？芍c對照組相比，模型組幼鼠肺組織NF-κBp65和p-NF-κBp65水平、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值、腦組織Iba-1水平升高；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺組織NF-κBp65和p-NF-κBp65水平、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值、腦組織Iba-1水平降低，隨劑量升高，各指標改善更為顯著。

1:對照組；2:模型組；3:丹酚酸B低劑量組；4:丹酚酸B中劑量組；5:丹酚酸B高劑量組

圖3 5組幼鼠腦組織Iba-1的免疫熒光染色(×200)

表5 5組幼鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65及腦組織Iba-1水平的比較

3 討論

肺炎以細菌性和病毒性肺炎較為多見，而細菌性肺炎的常見致病菌主要有金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌及鮑曼不動桿菌等[1-2]。由于兒童自身免疫系統發育尚未完全，所以肺炎患者中以兒童較為多見，同時表現出治療周期長的特點，若治療不及時，容易引發血行感染，進而導致細菌性腦膜炎的發生，嚴重者可導致患兒不可逆性智力下降，甚至死亡[2]。

丹酚酸B是從唇形科植物丹參的根及莖中提取得到的單體化合物，研究[3]表明丹酚酸B具有抗炎、心肌保護、抗腫瘤、免疫調節等多種藥理作用。近年來丹酚酸B對肺組織的保護作用及損傷修復作用也逐漸被發現。金粟等[8]發現丹酚酸B具有抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化病理進展的作用；同時，張敏等[9]發現丹酚酸B能夠通過抑制肺成纖維細胞TGF-β1/Smad信號通路抑制肺纖維化進展；梁家紅等[10]研究發現丹酚酸B具有明顯的抗炎及抗凋亡作用，從而發揮對急性肺損傷小鼠的保護作用。同時，研究[11]表明，丹酚酸B也有顯著的神經保護作用，其作用機制可能與抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的過度活化有關。研究[12]表明大鼠肺損傷后，TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高加重肺組織損傷，同時肺組織MDA水平的升高及SOD活性下降則加重了肺組織氧化損傷，所以在肺損傷后上述指標的改善直接關系到肺損傷的預后及轉歸。

本研究結果表明，與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，肺組織W/D、MDA水平降低；PaO2、OI、肺組織SOD活性升高，肺組織病理學損傷明顯改善；提示丹酚酸B能夠降低金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠體內炎癥因子水平和肺組織氧化應激水平，改善肺炎幼鼠肺組織病理學變化。NF-κB信號通路是機體內重要的信號轉導通路，與免疫、炎癥、應激反應等多種生物過程密切相關，研究[13]表明，NF-κB信號通路的過度激活可以誘導并加重體內炎癥反應。NF-κBp65為NF-κB蛋白家族的成員之一，在機體炎癥反應的發生及進展過程中起到關鍵作用。本研究表明，丹酚酸B各劑量組幼鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低，提示丹酚酸B能夠降低肺炎幼鼠NF-κB信號通路及相關蛋白水平，抑制NF-κBp65的磷酸化，進而發揮其抗炎及肺組織保護作用。

小膠質細胞廣泛分布在中樞神經系統，正常狀態下的小膠質細胞處于休眠或靜息狀態，當腦組織發生炎癥反應時，會激活小膠質細胞發生形態及功能變化，激活免疫應答，釋放大量炎癥介質及細胞毒素[14]，而Iba-1的高表達是腦組織小膠質細胞激活的標志。本實驗結果表明，與模型組比較，丹酚酸B各劑量組幼鼠逃避潛伏期及首次穿過平臺時間縮短，90 s內穿過平臺次數增加，提示丹酚酸B能明顯改善幼鼠的學習記憶能力；丹酚酸B各劑量組幼鼠腦組織Iba-1水平降低，提示丹酚酸B能夠顯著改善肺炎幼鼠腦組織小膠質細胞的激活，抑制腦組織炎癥反應，進而起到神經保護作用。

綜上所述，丹酚酸B能夠減輕金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠體內炎癥狀態，改善幼鼠肺組織及腦組織炎癥水平，保護幼鼠腦神經，提高幼鼠學習記憶能力。