p16/Ki67雙染、HPV E6/E7 mRNA檢測對于TCT檢查為低級別鱗狀上皮內病變及以下且HPV檢測為陰性或其他高危型HPV陽性患者的分流作用

李碧軍，郭瑞霞，王春芳，陳 曦，褚丹霞，王凱麗，杜建敏，白 晶

1)鄭州大學第一附屬醫院婦科 鄭州 450052 2) 鄭州大學第三附屬醫院婦科 鄭州 450052

宮頸癌是威脅全球婦女健康及生命的主要惡性腫瘤之一，目前其發病率占女性惡性腫瘤第4位[1]。近幾十年，隨著宮頸癌知識的普及和“兩癌”篩查的大力推廣，我國宮頸癌前病變及早期宮頸癌的檢出率逐年提高[2]。宮頸細胞學檢查是最早采用的宮頸癌篩查技術，具有較高的特異度，但其診斷敏感度可能因制片方法、染色水平及檢測醫師閱片水平而降低[3]。目前宮頸細胞學檢查主要采用TCT檢查。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)檢測對無癥狀感染者的癌前病變及宮頸癌的早期發現有重要的臨床價值，但特異度較低。細胞學聯合HPV檢查能提高宮頸癌前病變及宮頸癌的檢出率[4]，但同時也伴隨著高假陽性率及高比例陰道鏡轉診率，甚至由于過度干預帶來一系列并發癥，在育齡期女性尤為嚴重[5]。因此，一些生物標記物被嘗試應用于臨床，來分流細胞學結果為輕度異常或其他高危型HPV陽性患者中的高危人群，以便更好地識別真正的高級別病變。p16/Ki67、HPV E6/E7 mRNA即是其中2種新的生物標記物。p16/Ki67是一種能提示HPV轉化性感染的聯合生物學標志物；HPV E6/E7是宮頸致癌基因，對于宮頸癌前病變的診斷具有較好的特異性，能有效降低其誤診率[6-7]。本文將探討2種新的檢測方法對TCT提示為低級別鱗狀上皮內病變(LSIL) 及以下且HPV檢測為陰性或其他高危型HPV陽性患者的分流作用。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2018年10月至2019年10月在鄭州大學第一附屬醫院婦科門診接受宮頸癌篩查的患者資料。納入標準：①TCT檢查為LSIL及以下且HPV檢測為陰性或其他高危型HPV陽性(不包括HPV16、18陽性)，包括未見上皮內病變或惡變細胞(NILM)、意義未明的不典型鱗狀細胞(ASCUS)、LSIL。②有TCT、高危型HPV、p16/Ki67雙染色法(簡稱雙染)、高危型HPV E6/E7 mRNA(簡稱E6/E7)檢測及陰道鏡下活檢結果。陰道鏡活檢指征：高危HPV陽性，同時TCT為ASCUS或更高級別病變；高危HPV陽性持續超過12個月，TCT為NILM；高危HPV陰性，TCT為LSIL；高危HPV陰性，TCT為ASCUS持續超過12個月；高危HPV陰性，TCT為NILM，但婦科檢查時肉眼觀察疑似宮頸癌。排除既往曾接受過治療的宮頸病變患者，合并其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病或正在接受免疫抑制治療的患者，合并妊娠的患者。共入組414例，年齡19～70(43.6±12.1)歲，<30歲者63例(15.2%)，≥30歲者351例(84.8%)。

1.2雙染檢測使用p16/Ki67檢測試劑盒(CINtec PLUS 瑞士羅氏公司)，將盛在新柏氏細胞保存液中的宮頸脫落細胞進行程序化處理，制片、染色、封固，加蓋玻片，讀片。結果判定標準：以同一個細胞中同時出現細胞質棕色染色和細胞核紅色染色者為p16/Ki67雙染色陽性，否則為陰性。

1.3E6/E7檢測利用細胞學檢查的剩余細胞液在1周內采用定量檢測試劑盒(Quanti Virus 科蒂亞)檢測高危型HPV E6/E7 mRNA。結果用相關光單位(relative light units, RLUs)表示，超過發光閾值為陽性。

1.4陰道鏡檢查及活檢病理由專門婦科陰道鏡室醫師進行陰道鏡檢查(歐普C5陰道鏡)，并對可疑病變部位進行多點活檢，由2位病理醫師獨立閱片。根據2014年WHO女性下生殖道腫瘤分類標準將慢性炎癥、LSIL判為陰性；將高級別鱗狀上皮內病變(HSIL)及各種類型的宮頸癌判為陽性。

1.5統計學處理應用MedCalc和SPSS 21.0進行統計學分析。比較不同方法單獨或聯合檢測宮頸HSIL+病變的效能(靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值)。3種方法聯合檢測時有2種及以上檢測方法為陽性時，診斷為陽性；TCT聯合HPV檢測時有1種及以上檢測方法為陽性時，診斷為陽性(其中HPV檢測陽性為任一其他高危型HPV陽性)。采用McNemar檢驗比較雙染和E6/E7檢測以及TCT+HPV+雙染、TCT+HPV+E6/E7及TCT+HPV檢測HSIL+病變的效能，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1雙染和E6/E7檢測檢出宮頸HSIL+病變的結果和效能比較結果見表1、2。陰道鏡活檢病理結果中慢性炎癥156例，LSIL 108例，HSIL120例，鱗狀細胞癌21例，腺癌6例，神經內分泌癌3例。以活檢病理結果為金標準，HSIL+(HSIL和癌)患者占36.2%(150/414)，LSIL及以下(LSIL和慢性炎癥)患者占63.8%(264/414)。雙染檢出HSIL+96例，E6/E7檢出90例。

表1 雙染和E6/E7檢測檢出宮頸HSIL+病變的結果比較 例

2.2聯合檢測檢出HSIL+病變的結果和效能比較結果見表3～6，TCT+HPV+雙染檢出HSIL+118例，TCT+HPV+E6/E7檢出111例，TCT+HPV檢出135例。

表2 雙染和E6/E7檢測檢出宮頸HSIL+病變的效能比較 %

表3 聯合檢測檢出宮頸HSIL+病變的結果比較 例

表4 TCT+HPV+雙染和TCT+HPV+E6/E7檢出宮頸HSIL+病變的效能比較 %

表5 TCT+HPV+雙染和TCT+HPV檢出宮頸HSIL+病變的效能比較 %

表6 TCT+HPV+E6/E7和TCT+HPV檢出宮頸HSIL+病變的效能比較 %

3 討論

根據指南[8]推薦，對細胞學結果為ASCUS者，進行高危HPV檢測，結果陽性者推薦陰道鏡檢查，陰性者則繼續常規篩查；對結果為LSIL者，直接行陰道鏡檢查。但由于ASCUS中高危HPV的陽性率較高，因此大量患者被推薦陰道鏡檢查。但ASCUS中僅有15%、LSIL中僅有12%～28%的患者經組織學活檢證實為HSIL+，造成大量的過度診療[9]。HPV16陽性(有或無HPV18陽性)、其他高危型HPV 陽性和高危型HPV陰性婦女中發生HSIL+的比例分別為11.4%、6.1% 和0.8%[10]。由于大眾對宮頸癌的過度恐慌，出現其他高危型HPV陽性或TCT輕度異常(ASCUS、LSIL)時可能有焦慮情緒，由此會產生一系列的過度檢查和治療。

有研究[11]表明，抑癌基因p16及增殖細胞核抗原Ki67活性與腫瘤的發生、發展及預后密切相關，在宮頸病變的診斷中是很有意義的標志物。90%以上的HSIL+中P16蛋白呈現高表達，而在LSIL和慢性炎癥中常為局灶弱陽性或陰性表達[12]。在生理條件下,同一細胞內P16和Ki67蛋白的表達應當彼此排斥，當P16與Ki67蛋白在同一宮頸上皮細胞中同時檢出時，則提示細胞周期循環被破壞，細胞異常增殖，可作為提示HSIL+的指標[13]。國內外均有研究[6,12，14]表明，p16/Ki67雙染在宮頸癌篩查中表現出較高的靈敏度和特異度。Bergeron等[15]以及Atkins等[16]的研究均發現，在TCT檢查結果為ASCUS或LSIL的患者中，p16/Ki67雙染發現HSIL+的敏感度均與HPV檢測相似，但p16/Ki67雙染有著較高的特異度。但也有研究[17]指出，p16/Ki67雙染靈敏度較低，不能確保一些HPV持續感染者不被漏診。金蓉蓉等[18]、于靜等[19]研究發現p16/Ki67雙染在分流ASCUS/LSIL患者中有較好的篩查效能。Wright等[20]研究發現p16/Ki67在分流其他12種HPV高危陽性患者中具有重要作用。

眾所周知，HPV感染是宮頸癌的主要危險因素，而HPV E6/E7蛋白的表達水平與宮頸病變的進展程度及細胞的惡性轉化密切相關，HPV E6/E7 mRNA可能成為篩查HSIL+的有效指標。李曉林等[7]發現HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變檢出中具有較高的敏感度與特異度，在宮頸病變篩查中具有潛在應用價值。有研究[21]發現HSIL+組的 HPV E6/E7 mRNA 陽性率高于LSIL 組。HPV E6/E7 mRNA陽性提示癌基因正在轉錄期，對于這類患者是否應加強隨訪，進行3～5 a的密切隨診，及是否能預測LSIL的轉歸，仍有待進一步證實。

本研究收集了414例TCT檢查為LSIL及以下且HPV檢測為陰性或其他高危型HPV陽性(不包括HPV16、18陽性)的患者，發現p16/Ki67雙染和HPV E6/E7檢測的靈敏度相近，均在60%左右，但雙染特異度高于HPV E6/E7；聯合檢測發現，TCT+HPV+雙染檢測靈敏度略低于TCT+HPV檢測，但特異度較高，與上述文獻相符。說明在篩查時聯合雙染檢測，不僅保持了較高的靈敏度，還提高了篩查的特異度。但本研究尚存在一定局限性：首先，入組病例數還不足，需要多中心、大數據再進行驗證；其次，進行雙染制片時存在細胞數量過少、細胞稀疏和細胞團塊等，導致制片效果差；同時由于閱片時過于保守，導致雙染結果假陰性較多。本研究中TCT聯合HPV的篩查效能較低，可能與研究樣本不同有關，排除了許多HPV其他陽性或TCT結果為LSIL及以下但未進行活檢的患者，造成本研究中HSIL+例數過高。目前尚無研究證實p16/Ki67雙染對除宮頸鱗癌外其他類型病變的檢出作用，如宮頸腺癌、神經內分泌癌等特殊類型的病變。本研究中共有9例宮頸腺癌和宮頸神經內分泌癌，而p16/Ki67的結果均為陰性。由于樣本量較小，具體結論應擴大樣本量后進一步驗證。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki67表達與宮頸高級別病變密切相關，在TCT檢查為LSIL及以下且HPV檢測為陰性或其他高危型HPV陽性患者中，再聯合p16/Ki67檢測分流，不僅能保持較高的靈敏度還能提高特異度，從而提高篩查效能，降低陰道鏡轉診率，避免過度診療。