尼可地爾對大鼠腦梗死后神經元再生的影響

趙源征，楊卓瀅，何遠宏，孫若楠，苑和平

鄭州大學第五附屬醫院神經內科 鄭州 450052

腦卒中是我國最常見的腦血管病之一，分為缺血性卒中和出血性卒中。缺血性卒中即腦梗死最為常見。患者多有感覺、運動功能障礙，認知功能障礙和這些障礙給生活帶來極大不便。腦梗死目前的有效治療仍是超早期的溶栓治療以及后續的對癥藥物治療和康復治療，條件十分有限且治療效果欠佳[1-2]。尼可地爾(2-煙酰胺乙基-硝酸鹽酯)是一種ATP敏感型鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)開放劑，同時具有類硝酸酯活性，臨床上主要用于心臟疾病的治療。近來有研究[3-4]發現尼可地爾在血管性癡呆，亨廷頓病等腦部疾病中發揮保護作用。本研究通過建立大鼠腦梗死模型，探討尼可地爾對神經元再生的作用和機制，為腦梗死的臨床藥物研究提供相關的理論基礎。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器尼可地爾(北京四環科寶制藥有限公司)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，美國Sigma公司)，大鼠用大腦中動脈閉塞(MCAO)線栓(北京西濃科技有限公司)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京康為試劑生物科技有限公司)，小鼠抗大鼠BrdU(抗體美國CST公司)，兔抗大鼠NeuN抗體、驢抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、PCR所用引物的設計(上海生工生物工程有限公司)。冰凍切片機(德國萊卡儀器有限公司)，Western blot電泳及轉印槽(美國BIO-RAD儀器有限公司)，PCR儀(德國Eppendorf有限公司)，熒光顯微鏡(德國ZEISS光學儀器有限公司)。

1.2大鼠MCAO模型[5]的建立及分組處理90只SPF級雄性SD大鼠，體重200～240 g，分為3組：假手術組、腦梗死組和尼可地爾組，每組30只。大鼠經體積分數10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定，頸部備皮、消毒，沿正中線剪開皮膚，小心剝離組織，露出右側頸內動脈、頸外動脈和頸總動脈，結扎頸外動脈，活結結扎頸總動脈和頸內動脈，在動脈間剪一小口，將線栓小心送入，直至大腦中動脈起始段，長度約為(20.0±2.0)mm，停止線栓送入，1.5 h后拔出線栓尾端約10 mm，假手術組線栓送入大腦中動脈起始段后立馬拔出，其余步驟同另外兩組。手術期間使用恒溫加熱墊，使大鼠體溫保持在37 ℃左右。Zea-Longa法評分1～3分為造模成功。尼可地爾為粉末狀，溶于生理鹽水中，術后24 h按7.5 mg/(kg·d)的劑量給尼可地爾組大鼠灌胃，其余組給予同等劑量的生理鹽水[6]，直至實驗前1天。腦梗死組和尼可地爾組自術后24 h開始腹腔注射BrdU，劑量為50 mg/kg，連續注射13 d[7]。

1.3神經功能缺損評分術后第1、3、7、14天，腦梗死組和尼可地爾組每組取10只大鼠。按照Zea-Longa標準[8]對兩組大鼠的神經功能進行評分。0分：正常，無神經功能缺損；1分：左側(癱瘓側)前爪不能完全伸展，輕度神經功能缺損；2分：行走時大鼠向左側(癱瘓側)轉圈，中度神經功能缺損；3分：行走時大鼠身體向左側(癱瘓側)傾倒，重度神經功能缺損；4分：不能自發行走，有意識喪失。

1.4腦含水量測定術后第3天，各組取6只大鼠麻醉，快速取腦，剝離梗死側大腦半球，立即稱重，以獲得濕重。隨后在100 ℃的干燥箱內烘干24 h，再次稱重，獲得干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%[9]。

1.5TUNEL法[10]檢測大鼠腦梗死周圍區細胞凋亡術后第3天，每組取6只大鼠，用PBS、體積分數4%多聚甲醛灌注心臟，至大鼠全身僵硬，快速取腦，放于體積分數4%多聚甲醛固定后，再置體積分數30%蔗糖中直至沉底。OCT包埋，20 μm厚冰凍切片。取腦片，室溫下放置于PBS中漂洗3次(10 min/次)，37 ℃濕盒中避光孵育，置于TUNEL混合液中1 h，再次置于PBS中漂洗，滴加DAPI，封片，顯微鏡(×400)下觀察梗死周圍區細胞凋亡情況。每張切片選擇3個視野，Image J軟件計算陽性細胞數，取均值。

1.6腦組織BrdU/NeuN免疫熒光雙染檢測術后第14天，每組取6只大鼠，快速取腦，制作20 μm厚的冰凍切片。取腦片置于PBS中漂洗3次(5 min/次)，37 ℃下置于2 mol/L鹽酸溶液15 min，于0.1 mol/l硼酸溶液漂洗3次(10 min/次)[11]。PBS漂洗，PBST溶液處理30 min，體積分數1%BSA封閉30 min。加小鼠抗大鼠BrdU一抗(按照1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱過夜。PBS漂洗，驢抗小鼠二抗(按照1∶500稀釋)室溫孵育2 h。PBS漂洗，體積分數1%BSA封閉30 min，再加兔抗大鼠NeuN(按照1∶300稀釋)，4 ℃冰箱過夜，PBS漂洗，山羊抗兔二抗(按照1∶500稀釋)室溫孵育2 h，PBS漂洗，滴加DAPI，封片。熒光顯微鏡下觀察染色情況。每個切片選擇梗死周圍區域的3個不重疊的區域，Image J軟件計算陽性細胞數，取均值。

1.7大鼠腦梗死周圍區NeuN的mRNA的RT-PCR檢測術后第14天，3組各取6只大鼠(來自1.3實驗后)，深度麻醉后，快速取腦，剝離梗死周圍區組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，反轉錄合成cDNA后，進行PCR擴增反應，引物序列如下：NeuN上游5’-CCCTCCCTCAGCAGACAC-3’，下游5’-TCAGCAGCCGCATAGACTCTACC-3’；GAPDH上游5’-GACATGCCGGGAGAAAC-3’，下游 5’-AGC CCAGGATACCCTTTAGT-3’。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s, 61 ℃退火30 s, 75 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用20 g/L瓊脂糖凝膠進行分離。凝膠使用Alpha Innotech成像儀(BIO-RAD)進行分析。以目的基因條帶與內參條帶灰度值的比值作為目的基因的相對表達水平。實驗重復3次。

1.8大鼠腦梗死周圍區NeuN蛋白的Western blot檢測術后第14天，3組各取6只大鼠(4只來自1.3實驗后,2只為另取)，麻醉后，快速取腦，剝離出梗死周圍區組織，與RIPA裂解液充分混勻，置于勻漿機上充分勻漿后，4 ℃、14 000 r/min離心[12]。吸取上清液，加入5×SDS上樣緩沖液煮沸后離心，再次吸取上清液，置-80 ℃冰箱備用。蛋白樣品用80 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白小心轉移至PVDF膜上，50 g/L脫脂牛奶封閉1 h，TBST漂洗3次(10 min/次)，4 ℃冰箱孵育兔抗大鼠NeuN一抗(按照1∶5 000稀釋)過夜，TBST漂洗3次(10 min/次)，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(按照1∶2 000稀釋)后室溫孵育1 h，TBST漂洗后，加入ECL發光液，置于光密度成像系統中觀察蛋白條帶情況并拍照，以GAPDH作內參。以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.9統計學處理采用SPSS 22.0進行數據分析，兩組大鼠神經功能缺損評分的比較采用重復測量數據的方差分析；3組大鼠腦含水量，梗死周圍區凋亡細胞數、BrdU/NeuN陽性細胞數、NeuN mRNA和蛋白表達的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組大鼠神經功能缺損評分結果見表1。

表1 兩組大鼠不同時間點Zea-Longa評分(n=10)

與腦梗死組相比，尼可地爾組在第3、7、14天的評分明顯降低。且隨著時間的推移，兩組腦梗死大鼠神經功能缺損評分均有下降的趨勢。

2.23組大鼠腦含水量及梗死周圍區凋亡細胞個數比較結果見表2。腦梗死組較假手術組腦含水量明顯升高；與腦梗死組相比，尼可地爾組腦含水量明顯降低。假手術組僅見到少數凋亡細胞，而腦梗死組凋亡細胞數明顯增加，尼可地爾組較腦梗死組凋亡細胞數明顯降低。

2.33組大鼠腦組織BrdU/NeuN的免疫熒光雙染結果見圖1、表2。

表2 3組大鼠腦含水量及凋亡細胞個數(n=6)

A：假手術組；B：腦梗死組；C：尼可地爾組；1：BrdU(紅色)；2：NeuN(綠色)；3：Merged(橙色)

2.43組大鼠腦梗死周圍區NeuN mRNA和蛋白表達的比較結果見表3。假手術組NeuN的mRNA以及蛋白含量較低，腦梗死組NeuN的mRNA以及蛋白含量明顯增加；尼可地爾組NeuN的mRNA以及蛋白含進一步升高。

表3 3組大鼠腦梗死周圍區NeuN的mRNA和蛋白表達的比較(n=6)

3 討論

腦梗死為腦部血管狹窄、閉塞或供血不足，使得血管支配區域腦組織缺血壞死，神經功能受到破壞。梗死區中心部分的細胞缺血壞死，難以逆轉，梗死中心區周圍的區域被稱為缺血半暗帶，其中的細胞大部分處于休眠狀態或半休眠狀態，僅能維持自身形態的完整，而無法行使正常功能[13]，拯救“缺血半暗帶”是臨床治療腦梗死的關鍵。本研究把重點區域固定在缺血半暗帶。

尼可地爾具有激活KATP通道的活性，同時具有類硝酸酯活性[14]。KATP通道是一種ATP敏感型鉀通道，開閉受胞內ATP/ADP比值的調節，其活性可被ATP抑制并被ADP激活。腦缺血時，ATP水平降低，KATP通道激活，引起細胞膜超極化，細胞興奮性降低，因此可以通過負反饋機制來穩定膜電位，調節神經元電活動和能量代謝的平衡[15]。同時，尼可地爾具有的類硝酸酯作用，可以通過釋放一氧化氮，起到擴張血管的作用。既往有研究[16]表明，尼可地爾可以通過增加腦血流量起到神經保護作用。

本研究結果表明尼可地爾組第3、7、14天的神經缺損明顯減輕，證明尼可地爾改善了腦梗死后的神經功能，促進其恢復。同時，腦含水量反映腦水腫的程度，腦水腫的程度可以反映腦部的炎癥情況，以及血腦屏障的通透性被破壞的程度。本研究結果顯示術后第3天(腦軟化期)尼可地爾組腦水腫明顯減輕。尼可地爾可能是通過激活KATP通道，膜電位回到靜息態，細胞興奮性降低，減少了興奮性遞質谷氨酸的釋放，抑制了Na+、Ca2+的大量內流，進而減輕了腦水腫[14]。

神經元是構成神經系統結構和功能的基本單位，在神經系統中占有重要地位。本研究用BrdU標記增殖的細胞，用NeuN標記成熟的神經元。BrdU是一種合成的胸腺嘧啶類似物，可替代胸腺嘧啶并在DNA合成的S階段滲透到復制的DNA分子中。如果靶細胞同時被兩種標記物標記，則我們將其視為雙陽性細胞，代表新增殖的神經元[17-18]。本研究結果顯示術后第14天，尼可地爾組大鼠腦梗死周圍區呈現更多的雙陽性細胞，表明尼可地爾促進神經發生。這可能和激活KATP通道的活性有關。既往有研究[19]表明，KATP通道開放劑會促進神經再生，具體機制可能是通過減少炎癥化合物的形成。本研究結果亦顯示尼可地爾的使用可以提高大鼠腦梗死周圍區NeuN mRNA和蛋白的含量。同時，我們發現尼可地爾的處理能明顯減少凋亡，這可能是由于激活了KATP通道，然后一方面通過維持離子穩態，另一方面通過降低細胞的能量需求，延緩一些有害的分解代謝過程的激活，減少由此帶來的酶系統的激活而引起的不可逆的細胞損傷[20-21]。

綜上所述，尼可地爾可以通過促進神經功能恢復、減輕腦水腫、減少細胞凋亡、促進神經元再生來達到神經保護，進而為腦梗死的臨床治療提供參考。