急性腦梗死患者外周血髓源抑制性細胞比例與預后的關系

何謙益，石曉娟，連晶瑤，劉莎莎，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院神經內二科 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤中心 鄭州 450052 4)河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052 5)鄭州大學生命科學學院 鄭州450001

卒中是人類致死和致殘的最主要病因之一，且多數為缺血性卒中(腦梗死)。既往研究[1]顯示，發揮免疫抑制功能的免疫調節細胞能促進腦梗死后神經修復并發揮神經保護作用。髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressive cell, MDSC)是一群異質性未成熟骨髓細胞，是樹突狀細胞、巨噬細胞和粒細胞的前體，具有顯著的抑制免疫細胞應答的能力。MDSC根據細胞形態可以分為兩大類，粒細胞或多形核MDSC(polymorphonuclear MDSC, PMN-MDSC)與單核MDSC(monocytic MDSC, M-MDSC)。MDSC在缺血性疾病中發揮重要作用。急性心肌梗死24 h后，小鼠外周血以及缺血心肌組織中MDSC比例顯著上調，上調的MDSC在缺血心肌組織中發揮免疫抑制功能并起到加重心肌損傷的作用[2]。與健康人以及穩定性心絞痛患者相比，急性冠脈綜合征患者外周血MDSC比例上調并且發揮更強的免疫抑制功能[3]。在腎臟缺血再灌注模型小鼠中，脾臟以及骨髓中的MDSC比例均上調[4]，上調的MDSC發揮了減輕急性腎臟損傷和缺血再灌注損傷后的慢性腎纖維化的作用[5]。在缺血性肌肉損傷小鼠模型中，MDSC遷移至缺血肌肉組織中，并且發揮促進缺血組織血管新生的作用[6]。在腦缺血再灌注損傷小鼠模型中，脾臟、骨髓以及缺血半球中MDSC比例均上調，并且可能通過抑制細胞凋亡減輕腦缺血損傷[7]。但是，目前尚缺乏關于急性腦梗死患者外周血中MDSC比例變化的研究報道。本研究旨在探討急性腦梗死患者外周血MDSC比例是否較健康人增加，以及MDSC比例與急性腦梗死患者預后之間的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2018年10月至2019年10月鄭州大學第一附屬醫院收治的128例急性腦梗死患者為急性腦梗死組。另外從該院體檢科選取同時期年齡、性別相匹配的健康體檢者100例作為對照組。急性腦梗死患者均為首次發病，發病時間均在7 d以內，均經過核磁共振檢查確認并且符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》診斷標準，均根據該指南給予腦梗死常規治療。研究對象均自愿參加本研究并且簽署知情同意書。排除標準：①患有感染、自身免疫性疾病、癌癥或其他可能影響免疫系統穩態的疾病。②近期應用過類固醇、他汀類藥物、免疫抑制劑等影響外周血中免疫細胞水平的藥物。③妊娠或合并其他重要臟器功能不全者。

1.2臨床參數的采集及預后的評價收集研究對象的臨床資料，如年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史、房顫病史、冠心病病史、吸煙史、飲酒史等。納入研究的當天或第2天清晨采集研究對象空腹靜脈血，運用日立7600-20全自動生化分析儀檢測血清高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoproteins cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoproteins cholesterol, LDL-C)、總膽固醇、甘油三酯等指標。從患者納入本研究開始計算，對急性腦梗死患者進行為期90 d的電話或門診隨訪，隨訪結束時進行改良Rankin評分(modified Rankin scale, mRS)，mRS 0～2分的患者為預后好，3～5分為預后差[8]。本研究無患者死亡或失訪。

1.3外周血中MDSC的檢測取研究對象清晨空腹靜脈血5 mL置于加入肝素的無菌管中，用紅細胞裂解液(北京索來寶科技有限公司)裂解紅細胞后，剩下的細胞懸液清洗離心。向紅細胞裂解后的細胞懸液中加入HLA-DR-APC、CD11b-PE-Cy7、CD14-FITC、CD3-PerCP抗體4 ℃避光孵育30 min，用PBS清洗細胞并且用300 μL的FACS Buffer將細胞重懸，用流式細胞儀(BD FACSAria Ⅱ)檢測PMN-MDSC與M-MDSC比例。所用抗體均購于Biolegend公司。

1.4統計學處理采用SPSS 23.0對數據進行統計分析。兩組性別構成、高血壓、糖尿病、房顫、冠心病、吸煙史、飲酒史的比較采用χ2檢驗；年齡、血脂指標、MDSC不同亞群細胞比例的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；采用logistic回歸分析年齡、性別、糖尿病、高血壓、吸煙史、MDSC不同亞群細胞比例是否為預后的影響因素，并繪制ROC曲線。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組臨床資料的比較結果見表1。急性腦梗死組高血壓患病率高于健康對照組；兩組研究對象的年齡、性別構成，糖尿病、房顫、冠心病患病率，吸煙、飲酒情況，膽固醇、甘油三酯、LDL-C以及HDL-C水平等比較，差異均無統計學意義。

表1 兩組臨床資料的比較

2.2兩組外周血中MDSC比例的比較結果見表2。與健康對照組相比，急性腦梗死患者外周血中PMN-MDSC以及M-MDSC比例均升高。

表2 兩組外周血中MDSC比例的比較 %

2.3急性腦梗死患者預后好組與預后差組臨床參數的比較結果見表3。預后好組PMN-MDSC以及M-MDSC比例均高于預后差組，總膽固醇水平低于預后差組。

表3 急性腦梗死預后好組與預后差組臨床參數的比較

2.4急性腦梗死預后影響因素分析以PMN-MDSC比例、M-MDSC比例、年齡、性別(女=0，男=1)、吸煙史(無=0，有=1)、高血壓病史(無=0，有=1)、糖尿病病史(無=0，有=1)等為自變量，以急性腦梗死患者的預后為應變量(預后好為1，預后差為0)，進行logistic回歸分析，結果見表4。可知，PMN-MDSC及M-MDSC比例是急性腦梗死預后的影響因素，且PMN-MDSC及M-MDSC比例越高患者的預后越好。

表4 急性腦梗死預后影響因素logistic回歸分析結果

2.5PMN-MDSC以及M-MDSC比例對急性腦梗預后的預測價值結果見表5。

表5 PMN-MDSC和M-MDSC比例對急性腦梗死患者預后的判斷價值

3 討論

在腦梗死的超早期，小膠質細胞、粒細胞以及T細胞被招募至缺血腦組織并開始分泌大量的炎癥細胞因子，如IL-1β、IL-6、IFN-γ等[9]。除此之外，與損傷修復相關的細胞因子如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、血管內皮生長因子以及游離脂肪酸等分別在急性腦梗死患者腦組織、外周血及腦脊液中的表達也明顯升高[9]。而上述兩種細胞因子在MDSC的誘導增殖方面起著關鍵作用[10]。這也就解釋了為什么本研究觀察到急性腦梗死組患者外周血PMN-MDSC以及M-MDSC比例均較健康對照組增高。

雖然MDSC可以抑制多種免疫細胞的功能，但是其主要作用靶細胞為T淋巴細胞。目前人們普遍認為T細胞在急性腦梗死中起促進炎癥反應、加重神經損傷的作用[9]。因此，我們猜測MDSC主要通過抑制T細胞的功能來發揮腦卒中后神經保護作用。除此之外，MDSC還可能通過以下途徑發揮促進腦梗死恢復的作用：①促進血管新生。MDSC可以通過分泌血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子以及基質金屬蛋白酶9等促進腫瘤血管新生[11]。除了腫瘤，MDSC還可以在缺血性肌肉損傷小鼠模型中發揮促進血管形成的作用[6]。②控制腦梗死的高危因素。高血壓、高血脂、糖尿病等均是腦梗死的高危因素。既往研究[12]發現MDSC對高血壓有調節作用，可以通過產生過氧化氫抑制高血壓模型小鼠的血壓升高。MDSC在肥胖患者以及急性冠脈綜合征患者外周血中增加[13]，并可以通過減少B2、Th1和Th17細胞來抑制動脈粥樣硬化的進展[14]。MDSC在2型糖尿病患者外周血中增加，并且與糖尿病并發癥相關指標呈負相關，提示MDSC可能起著減緩糖尿病進程的作用[15]。我們的研究發現PMN-MDSC與M-MDSC比例越高，急性腦梗死患者的預后越好，與上述研究結果一致。

綜上所述，該研究結果顯示，MDSC比例在急性腦梗死患者外周血中增加。相比預后差的急性腦梗死患者，預后好的急性腦梗死患者外周血中PMN-MDSC以及M-MDSC比例更高。而且PMN-MDSC和M-MDSC比例是急性腦梗死患者預后的影響因素，可以作為預后判斷指標為臨床提供參考。