UPLC-MS-MS法檢測水產品中亮綠·孔雀石綠和結晶紫及其代謝物

宋 凱，嚴忠雍，張小軍，郭遠明

(浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316100)

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UPLC-MS-MS法檢測水產品中亮綠·孔雀石綠和結晶紫及其代謝物

宋 凱，嚴忠雍，張小軍，郭遠明

(浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316100)

[目的] 建立水產品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫、亮綠的快速檢測方法。[方法] 采用氯化鈉溶液與二氯甲烷液液萃取凈化，建立快速檢測水產品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫、亮綠的超高液相色譜-串聯質譜方法。[結果]孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫、亮綠5種化合物的標準曲線相關系數均大于0.992，信噪比均在10以上，加標回收率為80.40%～119.70%，相對標準偏差為3.4%～6.2%，說明該檢測方法具有良好的準確度和精密度。[結論] 建立的UPLC-MS-MS方法適用于水產品中亮綠、孔雀石綠、結晶紫及其代謝物的檢測。

亮綠；孔雀石綠；結晶紫；隱色孔雀石綠；隱色結晶紫；超高效液相色譜-串聯質譜

孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫、亮綠都屬于堿性三苯甲烷類染料，具有類似的結構(圖1)，在水產養殖過程中常用作殺菌劑和抗寄生蟲藥，用于防治各種魚病[1-3]。由于三苯甲烷具有致突變、致畸和致癌作用，歐美、我國和日本等已經嚴禁在水產養殖中使用孔雀石綠和結晶紫，并規定孔雀石綠(含隱色孔雀石綠)和結晶紫(含隱色結晶紫)不得檢出[4-6]。孔雀石綠因其效果明顯、價格低廉而被大量應用于鰻魚、鯉魚、鯽魚及其他水產苗種中，主要用于防治水霉病。但是，獸藥殘留作為水產品安全的首要問題直接影響到我國水產品質量安全及其出口創匯[7-9]。目前，在生產中使用孔雀石綠的不多，主要集中在水產品流通環節。

因此，對于水產品中孔雀石綠殘留量的持續檢測和監控十分重要。

目前，水產品中孔雀石綠的檢測方法有高效液相色譜法和液質聯用法[10-15]，但液相色譜法有其缺陷性，主要表現為方法的檢出限已達不到越來越嚴格的市場要求，目前通常采用乙腈提取亮綠、孔雀石綠與結晶紫，采用正己烷進行去脂凈化[16-20]，但正己烷會造成目標物損失，特別是隱色結晶紫和隱色孔雀石綠損失。為了降低目標物的損失率，筆者采用氯化鈉溶液與二氯甲烷液液萃取凈化，在保證高回收率的同時降低了樣品的基質干擾，提高了靈敏度，適用于水產品中亮綠、孔雀石綠、結晶紫及其代謝物的檢測。

1 材料與方法

1.1.1 儀器。UPLC-Quattro Premier XE超高效液相色譜-串聯質譜儀(Waters公司)；食品加工機(飛利浦)；高速離心機TDL-5-A(上海飛鴿)；旋渦混合器XW-80A(上海青浦滬西)；旋轉蒸發儀NA-1001-WA(日本東京EYELA)；中性氧化鋁小柱(LC-Alumina-N)。

1.1.2 試劑及其配制。孔雀石綠、結晶紫、隱色孔雀石綠、隠色結晶紫、亮綠，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、二氯甲烷、異丙醇、乙酸銨、甲酸、冰乙酸均為色譜純，購自天津科密歐公司；氯化鈉、硫酸鈉，均為分析純，購自天津科密歐公司；超純水，使用Millipore超純水器自制。取0.5 ml甲酸加入到500 ml的乙腈中，搖勻。稱取0.19 g乙酸銨溶于500 ml水，然后向其中加入0.5 ml甲酸，搖勻。按照乙腈：5 mmol/L乙酸銨(用冰乙酸調節pH至4.5)=8∶2進行定容。

1.2 標準儲備液和標準工作液的配制

1.2.1 標準儲備液的配制。分別稱取10.000 0 mg(精確至0.000 1 mg)的MG、LMG、CV、LCV、BG 5種標準品，用乙腈溶解并定容至100 ml，制成濃度為100 μg/ml的標準儲備液，0～4 ℃條件下避光保存。

1.2.2 混合標準儲備液的配制。各取MG、LMG、CV、LCV、BG儲備液10 ml，用乙腈稀釋定容至100 ml，制成濃度為10 μg/ml的混合標準儲備液，0～4 ℃避光保存。

1.2.3 混合標準中間液及工作液的配制。移取10 ml混合標準儲備液，用乙腈稀釋定容至100 ml，制成1 μg/ml的混合標準中間液，標準品工作液按照需要逐級稀釋，低濃度標準品工作液臨用時使用定容溶劑稀釋配制。

1.3 液相色譜分析條件

色譜柱：BEH C18柱(2.1 mm×50 mm)，粒徑1.7 μm；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：20 ℃；進樣體積：5 μl；流動相：A緩沖鹽溶液(5 mmol/L乙酸銨水溶液、0.1%的甲酸)、B乙腈(0.1%的甲酸)；流速為0.25 ml/min 梯度洗脫，具體梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4 質譜分析條件

電噴霧離子源：正離子電離(ESI+)；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：100 ℃；二級錐孔電壓：3 V；錐孔反吹氣：50 L/h；去溶劑氣溫度：350 ℃；去溶劑氣流量：700 L/h；低質量分辨率LM1 13.0，高質量分辨率HM1 13.0，離子能量1為0.5 V，碰撞室入口電壓為0 V，碰撞室出口電壓為0 V，碰撞氣流量為0.2 ml/min，碰撞室壓力為3.0×10-3Pa，低質量分辨率LM2為13.0，高質量分辨率HM2為13.0，離子能量2為1.0 V，光電倍增管電壓為650 V。在質譜分析過程中，以保留時間和離子對信息比較進行定性分析，以母離子和響應值高的子離子進行定量。孔雀石綠等5種化合物在MRM模式下的質譜參數如表2所示。

表2 5種化合物的質譜參數

1.5 方法

1.5.1 取樣。取水產品可食用部分充分絞碎混勻后，稱取5.00 g(精確至0.01 g)置于50 ml離心管中。

1.5.2 提取。向離心管中加入15 ml乙腈，充分振蕩提取，旋渦混合3 min，5 000 r/min離心分離，重復提取1次，合并2次上清液，并轉入250 ml分液漏斗中。

1.5.3 轉容凈化。向分液漏斗中加入20 ml 10%氯化鈉水溶液，20 ml二氯甲烷，振蕩3 min(注意放氣)，靜置分層后，去除下層水相；上層乙腈和二氯甲烷層過預先用乙腈淋洗的無水硫酸鈉脫水凈化，并收集到茄形瓶中，然后用20 ml乙腈分數次洗滌硫酸鈉，濾液一并轉入茄形瓶中。

1.5.4 濃縮溶解。加入10 ml異丙醇，40 ℃以下濃縮至干，用2 ml定容溶液溶解殘渣。

1.5.5 再凈化。殘渣溶解液過中性氧化鋁，前面3～5滴流出液棄去，全部收集隨后的流出液并過0.2 μm濾膜。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的相關系數

將濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/L的混合標準系列，依次進樣，進樣量均為5 μl，化合物MG、LMG、CV、LCV和BG的標準曲線相關系數分別為0.998 026、0.994 963、0.995 248、0.992 089和0.995 606。

2.2 檢測限

進樣0.5 μg/L的5種化合物(MG、LMG、CV、LCV、BG)的混合標準物質，將儀器檢測限定為1.0μg/L，孔雀石綠(MG)、隱色孔雀石(LMG)、結晶紫(CV)、隱色結晶紫(LCV)和亮綠(BG)在UPLC/MS/MS上的信噪比分別為1 072.37、1 177.39、138.26、39.29和210.35。

2.3 質譜分析結果

從圖2可以看出，孔雀石綠、隱色孔雀石、結晶紫、隱色結晶紫和亮綠的保留時間分別為2.22、2.77、2.30、2.57和2.42 min。

2.4 添加回收試驗

分別以魷魚和章魚為空白樣品進行基質回收試驗，在0.1和0.2 μg/kg水平上進行加標回收試驗。由表3可知，亮綠、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫和隱色結晶紫的平均回收率為80.40%～119.70%，相對標準偏差(RSD)為3.4%～6.2%，說明具有良好的準確度和精密度。

表3 魷魚和章魚中5種化合物的回收率

3 小結

該試驗建立的UPLS-MS-MS方法避免了目標物的大量損失，在優化的色譜質譜條件下對孔雀石綠(隱)、結晶紫(隱)和亮綠5種化合物實現了有效分離，并且出峰時間合適，檢測靈敏度較高，精密度良好，回收率較高，方法檢測定量限為5μg/kg，適用性均良好，可滿足水產品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫、亮綠5種化合物的檢測要求。

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Detection of Residual Amount of Malachite Green, Leucomalachite Green, Crystal Violet, Leuco Crystal Violet and Bright Green in Aquatic Products by UPLC-MS-MS

SONG Kai, YAN Zhong-yong, ZHANG Xiao-jun et al

(Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhejiang Province Key Lab of Mariculture & Enhancement, Zhoushan，Zhejiang 316100)

[Objective] The aim was to establish rapid detection method of malachite green, leuco-malachite green, crystal violet, leuco-crystal violet and bright green in aquatic products. [Method] The compounds were extracted and purified with sodium chloride solution and dichloromethane to establish UPLC-MS-MS for rapidly detecting malachite green , leucomalachite green, crystal violet, leucocrystal violet and bright green in aquatic products. [Result] The correlation coefficients of the standard curve of five kinds of compounds(malachite green, leuco-malachite green, crystal violet, leuco-crystal violet and bright green ) were all more than 0.992, the signal-noise ratio was all more than 10, and the addition recovery was 80.40%-119.7% withRSDof 3.4%-6.2%, which indicated that the detection method had good accuracy and precision. [Conclusion] The established UPLC-MS-MS is suitable for detecting malachite green, leuco-malachite green, crystal violet, leuco-crystal violet and bright green in aquatic products.

Bright green；Malachite green；Crystal violet；Leucomalachite green；Leucocrystal violet；UPLC- MS-MS

浙江省科技廳公益技術研究農業項目(2015C32001)；浙江省科技計劃項目(2014F50001)。

宋凱(1983- )，男，山東德州人，工程師，碩士，從事水域環境監測和食品檢測。

2015-10-31

S 912

A

0517-6611(2015)35-164-03