蒙山牛肝菌液體發酵培養基的優化

徐曉蝶， 牟敏捷， 朱婷婷， 邱國良， 郝繼偉

(臨沂大學生命科學學院，山東臨沂 276000)

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蒙山牛肝菌液體發酵培養基的優化

徐曉蝶， 牟敏捷， 朱婷婷， 邱國良， 郝繼偉*

(臨沂大學生命科學學院，山東臨沂 276000)

[目的] 優化蒙山牛肝菌液體發酵培養基。[方法] 以菌絲干重為指標，首先采用單因素試驗篩選適于菌絲體生長的最佳碳氮源，再以正交試驗優化碳源與氮源以及無機鹽與VB1的最佳配比。[結果] 蒙山野生牛肝菌優化的液體培養基配方為乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L。[結論] 正交設計法優化的蒙山牛肝菌液體發酵培養基具有一定的應用價值，可為大規模發酵生產及后繼研究提供基礎數據。

正交設計；牛肝菌；液體培養基

牛肝菌(Boletussp) 是一種菌根真菌，通常與松樹的樹根形成共生菌根，屬擔子菌亞門層菌綱傘菌目牛肝菌科[1]。全世界范圍內已確定的牛肝菌屬共有130多種，在我國可食用的有31種[2]。蒙山牛肝菌是生長在沂蒙山區山林中的一類野生牛肝菌，具有獨特的風味和極高的營養價值，深受當地人們的喜愛，作為一種藥用真菌具有很大的商業開發潛力。

牛肝菌作為一種菌根真菌，目前尚不能人工栽培，但其液體發酵培養菌絲的營養成分和其子實體的營養成分基本一致，通過液體發酵培養牛肝菌將是未來研究的趨勢[3]。筆者利用正交設計法，對野生蒙山牛肝菌液體發酵培養基中的主要成分進行優化，以期為大規模發酵生產及后繼研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種。蒙山野生牛肝菌鮮菇采自蒙山。

1.1.2 儀器設備。SW-CJ超凈工作臺，高壓滅菌鍋，DGG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱，SPX-250B-Z 型生化培養箱，EO2140型分析天平，DKY2型恒溫培養搖床，電磁爐。

1.1.3 培養基。①母種培養基：馬鈴薯(去皮)200 g，蔗糖20 g，麩皮30 g(煮汁)，VB10.5 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，瓊脂20 g，水1 000 ml。②液體菌種基礎培養基：蛋白胨3 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB10.5 g/L。③碳源優化培養基：以液體菌種基礎培養基中葡萄糖作對照，分別用乳糖20 g/L、麥芽糖20 g/L、蔗糖20 g/L、可溶性淀粉20 g/L、甘露醇20 g/L代替葡萄糖。④氮源優化培養基：以液體菌種基礎培養基中蛋白胨作對照，分別用酵母膏10 g/L、牛肉膏10 g/L、(NH4)2SO410 g/L、豆粕10 g/L代替蛋白胨。

1.2 試驗方法

1.2.1 斜面菌種制備。母種培養基滅菌后擺成斜面，在無菌條件下采用組織塊法將牛肝菌鮮菇接種到斜面培養基中部，然后置于25 ℃下培養15 d左右，即可得到蒙山牛肝菌的斜面菌種。挑選無污染、健壯的菌種備用。

1.2.2 液體菌種制備。液體菌種基礎培養基按配方配制好后，按每瓶150 ml倒入干凈的250 ml三角瓶中，用透氣封口膜封口并用牛皮紙包裹瓶口，于121 ℃下滅菌20 min。冷卻后，取0.5～1.0 cm2的母種塊接入液體菌種。先25 ℃下靜置培養2 d，然后120 r/min振蕩培養6 d，在瓶中即可看到大量菌球形成。

1.2.3 發酵試驗。無菌條件下用滅過菌的玻棒破碎液體菌種的菌球，然后按10%(V/V)的接種量用無菌吸管吸取液體菌種，接種于滅菌后的相應液體培養基中，在25 ℃、120 r/min的條件下振蕩培養3 d。

1.2.4 菌絲重量測定。發酵試驗后通過觀察剔除污染的試驗處理，如果由于污染影響到試驗結果的分析，需要補充相關試驗。將無污染三角瓶中的菌體與培養液的混合物置于80 目網篩上過篩，通過蒸餾水洗滌后，置于80 ℃干燥箱內干燥至恒重，稱重。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對菌絲生長量的影響

從圖1可以看出，蒙山牛肝菌在乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇6種培養基中都能生長。其中以乳糖、可溶性淀粉作碳源時，菌絲產量最高，所以選用乳糖、可溶性淀粉作為正交試驗的碳源因子。

2.2 不同氮源對菌絲生長量的影響

從圖2可以看出，蒙山牛肝菌對酵母膏、牛肉膏的利用效果較好，且二者的菌絲產量接近，但對銨鹽的利用效果較差，所以采用酵母膏、牛肉膏作為正交試驗的氮源因子。

2.3 碳氮源組合的優化

碳氮源組合優化基礎培養基為KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、VB10.5 g/L。根據單因素試驗的結果，在基礎培養基內添加不同濃度的乳糖和可溶性淀粉作為碳源，添加不同濃度的酵母膏和牛肉膏作為氮源，采用L9(34)正交試驗來確定碳氮源的最佳組合。試驗因素及水平見表1，并設3次重復。通過測定菌絲干重來確定碳氮源的最佳組合。

表1 碳氮源正交試驗的因素與水平 g/L

正交試驗結果見表2。對表2結果進行方差分析，結果表明，乳糖(A)與酵母膏(C)對試驗結果并無顯著影響(P>0.05)；而可溶性淀粉(B)與牛肉膏(D)對試驗結果有極顯著影響(P<0.01)，進一步結合表2極差分析結果R(B)>R(D)>R(A)>R(C)，可知4因素對試驗結果影響大小依次為可溶性淀粉、牛肉膏、乳糖、酵母膏。

由表2可知，處理A2B2C3D3菌絲干重最大，A3B2C1D2與A2B2C3D3無顯著差異，則二者均為最好水平組合。但從極差分析結果可知，A2B2C2D2應為最佳水平組合，該組合在正交試驗表中并未出現，需要作驗證試驗進行確認。驗證試驗結果表明，菌絲干重平均值為22.4 g/L，高于其他兩組合，但并無顯著差異。因此，A2B2C2D2雖為該試驗最佳水平組合，但由于乳糖與酵母膏對試驗結果無顯著影響，因此建議生產中因降低生產成本的需要可采用的最佳碳氮源組合為A1B2C1D2，即乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L。

表2 碳氮源正交試驗結果

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 無機鹽及維生素的優化

以碳氮源最佳組合即乳糖10 g/L、可溶性淀粉20 g/L、酵母膏5 g/L、牛肉膏10 g/L為供試基礎培養基。在培養基內分別添加不同濃度的KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1，采用L9(34)正交試驗確定無機鹽與維生素的最佳配比，試驗因素及水平見表3，并設3次重復。通過測定菌絲干重來確定無機鹽與維生素的最佳配比。

表3 無機鹽及維生素正交試驗因素與水平 g/L

正交試驗結果見表4。對表4試驗結果進行方差分析，結果表明，KH2PO4(A)與MgSO4·7H2O(B)對試驗結果有極顯著影響(P<0.05)；而VB1(C)對試驗結果無顯著影響(P>0.05)，進一步結合表4極差分析結果R(A)>R(B)>R(C)，可知3因素對試驗結果影響大小依次為KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1。

由表4可知，處理A2B2C3菌絲干重最大，與A2B1C1、A1B2C2和A2B3C2間無顯著差異，但從極差分析結果可知，A2B2C2應為最佳水平組合，該組合在正交試驗表中并未出現，需要作驗證試驗進行確認。驗證試驗結果表明，菌絲干重平均值為22.8 g/L，與A2B2C3相近。考慮到VB1(C)對試驗結果無顯著影響，因此建議生產中采用的無機鹽及維生素組合為A2B2C1，即KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L。

表4 無機鹽及維生素正交試驗結果

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

該研究表明，蒙山野生牛肝菌液體培養基最佳配方為乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L,與張揚等[4]對紅絨蓋牛肝菌的研究、郭永月等[5]對黑牛肝菌的研究、冮潔等[6]對美味牛肝菌的研究略有差別，主要原因為牛肝菌品種不同。但以上研究中有一共同點，即其配方中的碳氮源均為有機的，由此可見牛肝菌在液體培養中對營養物質的需求較全面。

在通過正交設計法優化培養基的過程中，多數人單純根據極差法得到最佳組合[4]，往往得出的結論較片面化、理論化。而極差法與方差分析法相結合得到的結論更加合理、應用性更強。該試驗中得出的最佳配方為乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，相較于單純根據極差法得到的結論可以減少非顯著因素的用量，在生產上可節約生產成本，提高一定的經濟效益。

[1] 茆曉嵐.中國經濟真菌[M].北京:科學出版社,1998:328.

[2] 李泰輝，宋斌．中國食用牛肝菌的種類及其分布[J]．食用菌學報，2002，9(2)：22-30.

[3] 邵力平，沈瑞祥，張素軒，等.真菌分類學[M].北京：中國林業出版社，1984：247-278.

[4] 張揚，趙陽，范克勝，等．紅絨蓋牛肝菌發酵培養基篩選及液體培養條件[J]．林業科技開發，2013，27(4)：111-114.

[5] 郭永月，陶明煊，周斌，等．黑牛肝菌液體發酵條件的優化[J]．食品工業科技，2012，33(9)：183-186.

[6] 冮潔，張茜.美味牛肝菌液體培養及其在醬油生產中的應用[J]．食品工業科技，2009，30(7)：223-226.

The Optimization of Liquid Fermentation Medium of Mengshan Mountain Boletus

XU Xiao-die, MU Min-jie, ZHU Ting-ting, HAO Ji-wei*et al

(College of Life Science, Linyin Normal University, Linyi, Shandong 276000)

[Objective] The aim was to optimize liquid fermentation medium of Mengshan mountain boletus. [Method] Adopting mycelial dry of Mengshan mountain boletus as major index, firstly the single factor method was used to select the best carbon source and nitrogen source for mycelium growth, and then the optimum ratio of carbon source, nitrogen source, inorganic salt and VB1was optimized by the orthogonal experiment. [Result] The optional liquid fermentation medium of Mengshan mountain boletus were as follow: lactose of 10 g/L，soluble starch of 20 g/L, yeast extract of 5 g/L, beef paste of 10 g/L, KH2PO4of 1 g/L，MgSO4·7H2O of 1 g/L. [Conclusion] The optimized liquid fermentation culture medium of Mengshan mountain boletus by the orthogonal design has a certain application value, and can provide the basic data for large-scale fermentation and subsequent research.

Orthogonal design; Boletus;Liquid fermentation medium

國家級大學生創業創新訓練計劃資助項目。

徐曉蝶(1997- )，女，安徽亳州人，本科生，專業：生物科學。*通訊作者，副教授，從事食藥真菌開發利用及野生資源保護方面的研究。

2015-10-20

S 336

A

0517-6611(2015)35-241-02