外源一氧化氮對UV-B脅迫下紅松幼苗光合特性和活性氧代謝的影響

魏曉雪，楊 臣，張文天，李德文

(1.黑龍江省科學院火山與礦泉研究所，黑龍江五大連池 164155；2.東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040)

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外源一氧化氮對UV-B脅迫下紅松幼苗光合特性和活性氧代謝的影響

魏曉雪1，楊 臣1，張文天1，李德文2*

(1.黑龍江省科學院火山與礦泉研究所，黑龍江五大連池 164155；2.東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040)

[目的]研究外源一氧化氮對增強UV-B輻射脅迫后紅松幼苗光合特性和活性氧代謝的影響。[方法]設4個組：①CK；②SNP (0.01 mmol/L)；③UV-B (4.22 kJ/(m2·d))；④SNP(0.01 mmol/L)+ UV-B(4.22 kJ/(m2·d))。分別于處理1、3、5、7、9 d取樣，測定各項生理指標。[結果] 施加外源NO，顯著增加紅松幼苗針葉光合色素含量，緩解UV-B對光合作用的破壞；外源NO處理降低UV-B脅迫對紅松幼苗針葉細胞膜的膜相對透性的破壞及MDA含量的積累；UV-B處理和SNP+UV-B處理都提高了APX、SOD和POD活性。[結論]植物防衛反應信號分子NO廣泛參與紅松幼苗對UV-B脅迫的應答與防御。外源NO對紅松幼苗由于UV-B輻射引起的氧化損傷有明顯的緩解作用。

外源NO；UV-B脅迫；紅松；生理指標

一氧化氮(Nitric oxide,NO)是一種廣泛存在于生物體內的氣體活性分子，也是一種活性氮(Reactive nitrogen species,RNS)。它在植物體內主要通過一氧化氮合成酶(NOS)和硝酸還原酶(NR)催化形成[1]。作為一種化學性質活躍的生物自由基，NO在植物生長發育、抗逆性等多種生命活動中充當第二信使[2]。來源于NOS系統的NO是UV輻射下產生的信號分子。UV輻射導致的植物生長受到抑制是通過影響細胞壁降解酶活性，改變細胞壁化學特性和機械延展性而實現的。作為UV輻射的第二信使NO介導了這一過程[3]。NO作為UV-B輻射產生的第二信使已成為現今植物逆境生理和信號轉導領域的研究熱點[4]。

Beligni等[5]研究表明，植物細胞內的NO具有雙重生理效應，其中低濃度NO具有保護作用，而高濃度NO則具有生理毒性。前人研究證明，外源NO可減少脅迫條件下植物體內的活性氧積累，從而緩解干旱、低溫等脅迫條件對植株造成的傷害[6-7]。段凱旋等[8]研究發現，適當濃度的外源NO可通過提高平邑甜茶根系和葉片的抗氧化酶活性，降低銅、鎘脅迫下O2-·產生速率、MDA含量，從而起到保護幼苗的作用。付士磊等[4,9]分別研究了外源NO對干旱脅迫下楊樹幼苗和核桃幼苗生理特性的影響。目前，關于外源NO提高植物抗逆性的報道主要集中于鹽脅迫和干旱脅迫研究方面，且多集中于草本植物。關于木本植物的研究較少，迄今很少涉及外源NO對UV-B脅迫下紅松幼苗生理作用的研究報道。

紅松(Pinuskoraiensis)是整個北半球中高緯度地區分布面積最大的三大五針松之一，是目前世界上珍貴而稀有的多用途樹種之一[10]。選擇3年生人工種植的紅松幼苗為材料，筆者研究了外源NO對UV-B脅迫下紅松幼苗光合參數、葉綠素含量以及活性氧代謝系統的影響，為了解NO提高植物抗逆性的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 試驗于2011年1月3～10日在東北林業大學森林植物生態學重點實驗室溫室內進行。試驗材料為3年齡紅松幼苗，將幼苗隨機分為4組，每組60株。供試土壤的基本理化性質為：pH 5.6，速效氮200 mg/kg，速效磷90 mg/kg，速效鉀200 mg/kg，有機質2.5%。試驗設4個處理：①CK；②SNP (0.01 mmol/L)；③UV-B (4.22 kJ/(m2·d))；④SNP(0.01 mmol/L)+ UV-B(4.22 kJ/(m2·d))。CK為溫室內自然條件處理。UV-B處理組為在溫室內自然光照基礎上人工增加4.22 kJ/(m2·d)輻射強度的UV-B(280～320 nm)光照。UV-B輻射處理通過懸在植株上方的UV-B輻射燈管產生。處理時間為每天12 h(6:00～18:00)。UV-B輻射強度用光譜儀AvaSpec 2048-2進行測定。生物有效輻射用Caldwell[11]文獻方法標定到300 nm植物響應作用光譜加權處理獲得。用文獻[12]模型，算得補增UV-B輻射的強度。

外源NO供體用硝普鈉(SNP)制得。先配制1 mmol/L SNP母液，4 ℃保存，用時按試驗所需的濃度進行稀釋。CK和UV-B處理噴施清水，SNP處理用0.01 mmol/L SNP溶液100 ml均勻噴施于葉面。每個處理均隨機取樣，處理1、3、5、7、9 d后測定各項生理指標。

1.2 試驗方法

1.2.1 Pn-PAR響應曲線的測定。選天氣晴好的上午，用LI-6400便攜式光合儀，在人工紅藍光源，氣溫(Tair) 24～27 ℃，相對濕度(RH) 50%～70%，CO2濃度為400 μmol/(m2·s)，光合有效輻射(PAR)強度分別設定為1 800、1 200、1 500、1 000、800、500、200、100、50、0 μmol/(m2·s)條件下，測定葉片凈光合速率(Pn)。用光響應模型，擬合Pn-PAR響應曲線[13]。

1.2.2 光合色素含量的測定。光合色素含量參考前人方法[14-15]測定。取0.05 g紅松針葉，剪碎，放入試管中，加入5 ml二甲基亞砜(DMSO)，黑暗下60 ℃水浴直至紅松針葉完全變白，以DMSO為空白，使用紫外可見分光光度計分別測定提取液480、649、665 nm的吸光值。根據相關公式，分別計算葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素的含量，單位為mg/g FW。

1.2.3 過氧化氫(H2O2)自由基含量的測定。H2O2與硫酸鈦(或氯化鈦)生成過氧化物-鈦復合物黃色沉淀，可被H2SO4溶解，在415 nm波長下采用比色法測定[16]。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的測定。MDA含量參照高俊鳳[17]的方法測定。

1.2.5 NO含量的測定。采用試劑盒法(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。取1 g針葉，加入40 mmol/L HEPES緩沖液(pH 7.2)3 ml,研磨，2 ml沖洗，用2層紗布過濾后，在8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液,參考說明書進行測定。

1.2.6 抗氧化酶活性的測定。抗氧化酶活性的測定參考前人方法[18]。取0.5 g新鮮紅松針葉，在液氮中充分研磨，迅速轉入含有5 ml 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0，含1 mmol/L EDTA和濃度1%PVP)的離心管中，10 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清液，棄沉淀，再10 000 r/min 4 ℃離心10 min，上清液即為粗酶液，4 ℃保存，備用。過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)的活性分別以每分鐘A240、A290和A470變化值表示；超氧化物歧化酶(SOD)活性以單位時間內抑制氮藍四唑光化還原50%為一個酶活性單位(U)。

1.3 數據分析 用Excel 2003 軟件進行數據處理。采用SPSS 13.0軟件，進行方差分析及顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 Pn-PAR響應曲線 由圖1可知，不同處理對紅松幼苗針葉Pn-PAR響應曲線的影響不同。處理9 d后，在PAR到達500 μmol/(m2·s)以后,SNP+UV-B處理凈光合速率顯著高于其他3個處理。與CK相比，SNP處理和UV-B處理凈光合速率數值差異不明顯。

2.2 光合色素含量 由表1可知，處理9 d后，與CK相比，SNP處理增加了紅松幼苗針葉中光合色素(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素)的含量，而UV-B處理和SNP+UV-B處理則在0.05水平顯著降低光合色素的含量。

表1 4個處理對紅松幼苗針葉光合色素含量的影響 mg/g

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 H2O2含量 由圖2可知，4個處理對紅松幼苗針葉中H2O2含量的影響不同。處理9 d后，與CK相比，其余3個處理都在0.05水平顯著提高H2O2含量。UV-B處理H2O2含量最高，達到300 μmol/g；SNP處理H2O2含量表現為升高趨勢；SNP+UV-B處理H2O2含量變化規律不明顯。

2.4 MDA含量 由圖3可知，處理9 d后，與CK相比，其余3個處理紅松幼苗針葉中MDA含量都在0.05水平顯著增加。隨著處理時間的延長，與CK相比，SNP處理MDA含量表現為先降低后升高的趨勢，處理9 d后SNP處理MDA含量最高；SNP+UV-B處理下前2次取樣MDA含量最高，而后含量降低，表現為先升高后降低的趨勢；UV-B處理MDA含量呈現先升高再降低的趨勢。

2.5 NO含量 由圖4可知，處理9 d后，與CK相比，其余3個處理都提高紅松幼苗針葉中NO含量，最大值出現在SNP+UV-B處理。隨著處理時間的延長，不同處理對NO含量的變化各不相同。SNP和UV-B處理下NO含量呈現先升高后降低的趨勢，除第1次取樣外，NO含量都高于CK，NO含量最大值有2次都出現在UV-B處理，而SNP+UV-B處理對NO含量并無明顯的影響。

2.6 抗氧化酶活性 由表2可知，處理9 d后，4個處理對紅松幼苗針葉中抗氧化酶活性影響各不相同。與CK相比，SNP和UV-B處理在0.05水平顯著降低CAT活性，SNP+UV-B處理則在0.05水平顯著提高CAT活性；與CK相比，其余3個處理都在0.05水平顯著提高APX和SOD活性，APX和SOD活性最大值出現在SNP+UV-B處理；與CK相比，SNP處理在0.05水平顯著降低了POD活性。UV-B處理和SNP+UV-B處理則在0.05水平顯著提高POD活性，SNP處理下POD活性最小，僅為3.09 U/(g·min)，UV-B處理下POD活性最大，高達74.78 U/(g·min)。

3 結論

(1)施加NO顯著增加了紅松幼苗針葉光合色素含量，表明外源NO有助于維持紅松幼苗針葉的葉綠素含量，外源NO緩解了UV-B對光合作用的破壞作用。

(2)外源NO處理降低了UV-B脅迫下紅松幼苗針葉細胞膜的膜相對透性、MDA的積累。外源NO處理引起UV-B脅迫下紅松幼苗針葉H2O2含量與H2O2代謝酶活力的變化，共同保護紅松幼苗不受過多活性氧的傷害，對UV-B脅迫導致的紅松幼苗活性氧傷害具有保護作用。

(3)植物防衛反應信號分子NO參與紅松幼苗對UV-B脅迫的應答與防御。NO作為UV-B輻射的第二信使介導紫外脅迫信號的轉導過程，并誘發植物產生抗性反應。外源NO對UV-B輻射脅迫導致的紅松幼苗傷害具有一定的緩解作用。

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The Effects of Exogenous Nitric Oxide on Photosynthetic Characteristics and Active Oxygen Metabolism inPinuskoraiensisSeedlings under UV-B Stress

WEI Xiao-xue1, YANG Chen1, ZHANG Wen-tian1, LI De-wen2*

(1. Institute of Volcanoes and Mineral Springs, Heilongjiang Academy of Science, Wudalianchi, Heilongjiang 164155; 2. Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] To research the influence of photosynthetic characteristics and active oxygen metabolize ofPinuskoraiensisSieb. et Zucc. seedling what was in UV-B stress which had been enhanced by exogenous NO. [Method] Four groups in this experiment were set up: ① CK; ② SNP (0.01 mmol/L), ③ UV-B (4.22 kJ/(m2·d), ④ SNP (0.01 mmol/L)+UV-B(4.22 kJ/(m2·d).Then took samples from each group and measured physiological indexes when they had been disposed 1, 3, 5, 7, 9 days. [Result] Adding exogenous NO had not only significantly increased the photosynthetic pigment content ofPinuskoraiensisseedling needles but also reduced damage of UV-B to photosynthesis. Adding exogenous NO reduced damage of UV-B stress to the membrane relatively permeability ofPinuskoraiensisseedling needles cytomembrane and accumulation of MDA content. Not only UV-B-dispose but SNP+UV-B-dispose could raise activity of APX, SOD and POD. [Conclusion] As the plant defense reaction signal molecule, NO partook reply and defense ofPinuskoraiensisseedling to UV-B-dispose widely. Exogenous NO could relievePinuskoraiensisseedling oxidation harm from UV-B radiation evidently.

Exogenous nitric oxide; UV-B radiation;Pinuskoraiensis; Physiological indexes

中央高校基本科研業務費專項(2572015CA03)；黑龍江省科學院科學研究基金項目；中央高校基本科研業務費專項(2572014EA01-02)。

魏曉雪(1982-)，女，黑龍江蘭西人，助理研究員，博士，從事植物生理生態方面的研究。*通訊作者，副教授，博士，從事植物生理生態方面的研究。

2015-04-20

S 791.247

A

0517-6611(2015)17-009-03