北方黃酒麥曲中真菌的篩選·鑒定及系統發育分析

譚婷婷，王家林，桑 戈，安寶禎

(青島科技大學生物系，山東青島 266042)

?

北方黃酒麥曲中真菌的篩選·鑒定及系統發育分析

譚婷婷，王家林*，桑 戈，安寶禎

(青島科技大學生物系，山東青島 266042)

[目的]對北方黃酒麥曲中真菌的5.8S rDNA-ITS序列進行PCR擴增、測序以鑒定其中的真菌。[方法]利用梯度稀釋法和劃線純化法共分離純化得到5株霉菌和1株酵母，并對分離得到的真菌進行基因組DNA提取獲得模板，用特異性引物進行PCR擴增，得到真菌的5.8SrDNA-ITS片段，片段測序后進行Blast比對鑒定，構建系統發育樹。[結果]將5株霉菌鑒定為多枝橫梗霉(Lichtheimiaramosa)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，產紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)，雜色曲霉(Aspergillusversicolor)，交鏈孢霉(Alternariamali)，將一株酵母鑒定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。[結論] 利用分子生物學的方法對北方黃酒麥曲樣品中的真菌進行了分離、純化和鑒定。

北方黃酒；麥曲；真菌；5.8SrDNA-ITS序列

黃酒具有幾千年的歷史，北方黃酒麥曲是將小麥進行過篩、軋碎、加水拌曲、踏曲、曲房堆曲、保溫培養、通風干燥、陳伏后制成[1]，是黃酒的糖化發酵粗酶制劑。麥曲中的微生物主要有霉菌、細菌及少量酵母，麥曲中的微生物參與黃酒的釀造過程，微生物及其代謝產物對黃酒的風味和口感具有十分重要的影響[2]。因此，對黃酒麥曲中微生物進行分類鑒定以及特性研究可以為黃酒的釀造提供理論依據，對于繼承和保護北方黃酒的傳統釀造工藝和口味具有積極的作用。

真菌核糖體基因轉錄間隔區，又叫內轉錄間隔區，是位于真菌核糖體DNA(rDNA)上18S和28S基因之間的區域片段，由ITS1區、5.8 S rDNA和ITS2區組成[3-4]。5.8 S rDNA-ITS序列有極大的保守性，具有顯著的種間差異性，在大多數真核生物中表現出極為廣泛的序列多態性。ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關系分析[5]。此外ITS序列片段較小、易于分析。筆者對北方黃酒麥曲中真菌的5.8S rDNA-ITS序列進行了PCR擴增、測序以鑒定其中的真菌。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所用的麥曲由山東即墨妙府老酒有限公司提供。

1.2 培養基的配制 YPD培養基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加入蒸餾水，調節pH至7.5，定容至1 L，115 ℃ 下滅菌30 min。

麥汁培養基：10度麥汁 1 L，瓊脂 20 g，115 ℃下滅菌30 min。

察氏培養基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，加入蒸餾水定容至1 L，0.1 MPa下滅菌20 min。

在滅菌后的培養基中添加50 mg/L的鏈霉素，抑制細菌生長；加入100 mg/L的去氧膽酸鈉，抑制菌絲蔓延。

1.3 方法

1.3.1 麥曲浸出液的制備。將粉碎好的麥曲20 g加入100 ml 0.9%的無菌生理鹽水中，加入玻璃珠放入搖床振蕩培養30 min，使麥曲中的微生物均勻地分散于無菌生理鹽水中，制成麥曲浸出液。

1.3.2 真菌的分離純化。將麥曲浸出液稀釋至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5倍，并分別涂布于麥汁培養基和察氏培養基上，每個稀釋倍數分別平行涂布3個平板，于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養48 h。挑取平板中肉眼可見的單菌落進行平板劃線，轉接劃線直至得到單菌落，之后進行鏡檢，確定是單一菌后，用YPD斜面進行保種，放入4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 真菌的形態學觀察。取分離得到的真菌菌株接種至YPD培養基，恒溫培養箱28 ℃培養48 h，觀察菌落的顏色、形態等菌落特征。

1.3.4 真菌的分子學鑒定。利用石英砂法提取真菌DNA。采用通用引物 pITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3′)和 pITS4(5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增真菌的 ITS 序列[3]。

25 μl 反應體系：18.35 μl ddH2O、2.5 μl 10×PCR Buffer、2 μl 4×dNTP、0.15 μlTaq酶，0.5 μl pITS1、0.5 μl pITS4、1 μl模板。 擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，然后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存備用。PCR 反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

使用DNA膠回收試劑盒進行回收純化，純化后的PCR產物克隆至pMD18-T載體上，連接后轉化至TOP10感受態細胞中[5]，篩選陽性克隆送至上海生工生物有限公司進行測序。登陸NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，將測得的試驗菌株序列在NCBI 的Genbank 中進行Blast分析，選取相似性較高的模式菌株的5.8S rDNA-ITS序列，與試驗菌株序列一起經Clustal X 軟件進行匹配后，用Mega 3.1 軟件進行分子系統學分析并構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 真菌的形態學觀察 共從麥曲浸出液中分離出6株霉菌和1株酵母，真菌依次編號為WSM-1、WSM-2、WSM-3、WSM-4、WSM-5和WTY。其形態學鑒定結果見表1。

表1 分離菌株的形態學鑒定結果

注：+ 為陽性; - 為陰性。

2.2 真菌的分子鑒定 所測5.8S rDNA-ITS序列提交GenBank進行Blast比對，對霉菌進行鑒定。同源性分析(表2)顯示這6種霉菌片段大小在571～859 bp。由試驗菌株和相關模式菌株所構建的系統發育樹(圖1)可以看出，25株菌株處于四大分支上。WSM-2與米曲霉(Aspergillusoryzae)和黃曲霉(Aspergillusflavus)聚為一支，且與米曲霉(A.oryzae)相似度為99%；WSM-4與聚多曲霉(Aspergillussydowii)和雜色曲霉(Aspergillusversicolor)聚為一支，且與雜色曲霉(A.versicolor)相似度為100%；WSM-3與朱黃青霉(Penicilliumminioluteum)和產紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)聚為一支，且與產紫青霉(P.purpurogenum)相似度為99%；WSM-5與交鏈孢霉(Alternariamali)聚為一支，相似度為100%；WSM-1與多枝橫梗霉(Lichtheimiaramosa)聚為一支，且相似度為99%。故WSM-1、WSM-2、WSM-3、WSM-4、WSM-5分別被鑒定為多枝橫梗霉(L.ramosa)、米曲霉(A.oryzae)、產紫青霉(P.purpurogenum)、雜色曲霉(A.versicolor)、交鏈孢霉(A.mali)。

由酵母和相關模式菌株所構建的系統發育樹(圖2)可以看出，WTY與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)親緣關系相近，可將其鑒定為釀酒酵母(S.cerevisiae)。

表2 麥曲中真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

3 結論與討論

該研究對北方黃酒麥曲樣品中的真菌進行了分離純化，共得到5株霉菌和1株酵母，利用分子生物學方法將5株霉菌鑒定為多枝橫梗霉(L.ramosa)、米曲霉(A.oryzae)、產紫青霉(P.purpurogenum)、雜色曲霉(A.versicolor)、交鏈孢霉(A.mali)。將一株酵母鑒定為釀酒酵母(S.cerevisiae)。

方華等[6]采用土豆瓊脂培養基、麥汁瓊脂培養基和察氏培養基對紹興黃酒麥曲中的真菌進行了分離、培養和鑒定，共分離出 16 株霉菌，其主要霉菌分別是微小毛霉、傘枝犁頭霉、米曲霉、米根霉和煙曲霉。與該研究相比，北方黃酒麥曲中的霉菌與紹興黃酒麥曲中都有米曲霉的存在，但多枝橫梗霉、產紫青霉、雜色曲霉、交鏈孢霉是北方黃酒麥曲所特有的。

[1] 陳細丹.黃酒生麥曲的傳統制作工藝[J].釀酒，2011，38(1)：59-60.

[2] 汪建國.傳統麥曲在黃酒釀造中的作用和特色[J].中國釀造，2004(10)：29-31.

[3] 趙杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子檢測中的應用[J].陜西農業科學，2004(4)：35-37.

[4] BELLOCH C，BARRIO E，URUBURU F，et al.Characterization of four species of the genus Kluyveromyces by mitochondrial DNA restriction analysis[J].Syst Appl Microbiol，1997，20：397-408.

[5] 鄭雪松，楊虹，李道棠，等.基因間隔序列(ITS)在細菌分類鑒定和種群分析中的應用[J].應用與環境生物學報，2003，9(6)：678-684.

[6] 方華，曹鈺，陸健，等.黃酒麥曲中主要霉菌的分子鑒定及分類[J].釀酒科技，2006，3(14)：45-47.

Screening, Identification and Phylogenetic Analysis of Fungi in the Wheat Starter from North Yellow Millet Wine

TAN Ting-ting,WANG Jia-lin*,SANG Ge et al

(Department of Biology, Qingdao University of Science & Technology, Qingdao,Shandong 266042)

[Objective] 5.8S rDNA-ITS fragments of fungi in the wheat starter from north yellow millet wine were amplified and sequenced in order to identify the fungi. [Method] Five strains of moulds and one yeast strain were separated and purified by gradient dilution method and crossed purification. The genomic DNA of fungi cells were extracted as the PCR template, and 5.8SrDNA-ITS fragments of fungi were amplified and sequenced respectively for blasting identify and phylogenetic tree construction. [Result]The moulds were identified asLichtheimiaramosa,Aspergillusoryzae,Penicilliumpurpurogenum,Aspergillusversicolor,Alternariamali,and one yeast strain was identified asSaccharomycescerevisiae. [Conclusion] Fungi in the wheat starter from north yellow millet wine were separated, purificated and identificated.

North yellow millet wine; Wheat starter; Fungi; 5.8SrDNA-ITS sequence

譚婷婷(1988- )，女，山東昌邑人，碩士研究生，研究方向：釀酒科學與工程。*通訊作者。

2015-04-15

S 188

A

0517-6611(2015)17-015-02