黑果腺肋花楸胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)

呂天舒， 利 爽， 高方可， 吳榮哲

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝園林系，吉林延吉 133002)

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黑果腺肋花楸胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)

呂天舒， 利 爽， 高方可， 吳榮哲*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝園林系，吉林延吉 133002)

[目的] 研究影響胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的因素，為三倍體植株再生奠定基礎(chǔ)。 [方法]以黑果腺肋花楸種子成熟胚乳為試材，研究取材時(shí)期、培養(yǎng)基種類、激素種類等因素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。[結(jié)果]取轉(zhuǎn)色期的胚乳在MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 2.0 mg/L+蔗糖40 g/L+瓊脂8 g/L的培養(yǎng)基上愈傷組織長勢最好，誘導(dǎo)率最高可達(dá)92%，顏色為黃綠色且結(jié)構(gòu)致密。[結(jié)論] 適宜黑果腺肋花楸胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)方法為轉(zhuǎn)色期取材，光照強(qiáng)度為800 lx，培養(yǎng)基配方為 MS+TDZ 0.05 mg/L+ IBA 2.0 mg/L+蔗糖 40 g/L+瓊脂 8 g/L。

黑果腺肋花楸；胚乳; 愈傷組織; 激素; 糖源

黑果腺肋花楸(AroniamelanocarpaElliot)隸屬于薔薇科腺肋花楸屬，是多年生落葉花灌木[1]。原產(chǎn)于美國東北部，歐洲已有 100 年的引種栽培歷史，20世紀(jì) 90 年代初引入我國[2]。其果實(shí)富含多種營養(yǎng)物質(zhì)如花色苷、黃酮類化合物、多酚類物質(zhì)，對心臟病、高血壓等心腦血管疾病及糖尿病均具特殊療效[3-5]。該樹種具有廣闊的開發(fā)前景，國內(nèi)關(guān)于黑果腺肋花楸栽培管理、組培快繁、果實(shí)果酒降酸及發(fā)酵等研究已經(jīng)日漸完善，均為其大范圍推廣種植和加工生產(chǎn)作出貢獻(xiàn)[6-9]。但關(guān)于黑果腺肋花楸的多倍化研究尚未見報(bào)道，而胚乳是天然三倍體，若能從胚乳培養(yǎng)獲得三倍體再生植株，便有可能選育出優(yōu)良的無核黑果腺肋花楸大果新品種，為果汁生產(chǎn)減少程序、節(jié)約成本，且三倍體果實(shí)中各類有效物質(zhì)含量可能更高、果實(shí)更大、植株抗逆性更強(qiáng)[10]。筆者研究影響胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的因素，為三倍體植株再生奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 將黑果腺肋花楸成熟種子用流水沖洗 30 min，放入 75% 乙醇中浸泡 40 s，用無菌水沖洗 3 次，再用 10% 的次氯酸鈉溶液浸泡消毒 5 min，用無菌水沖洗 4次[7]。在無菌條件下剝?nèi)ネ馄?切除胚芽)，接種于 MS+BA 0.1 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂 8 g/L(pH均為5.8)的培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 20 d 后作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取材時(shí)期對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。分別取青果期、轉(zhuǎn)色期和黑果期的種子胚乳依次接種在添加 BA 0.1 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖 50 g/L+瓊脂 8 g/L的 MS 培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿( Φ × h = 9 cm× 1.5 cm)中倒入培養(yǎng)基 40 ml，無菌條件下冷凝后接入愈傷組織4個(gè)。在溫度(20±2)℃、相對濕度70%條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，30 d后觀察愈傷組織長勢、顏色及結(jié)構(gòu)，并調(diào)查各時(shí)期的誘導(dǎo)率。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

誘導(dǎo)率 = 產(chǎn)生愈傷組織的塊數(shù)/總接種量×100%

1.2.2 培養(yǎng)基種類對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響。將最佳取材時(shí)期的愈傷組織分別接種在添加 BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L +蔗糖 50 g/L+瓊脂 8 g/L的 MS、WPM、White、B5 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選最佳培養(yǎng)基。其他試驗(yàn)方法、步驟、測定項(xiàng)目同“1.2.1”。

1.2.3 光照強(qiáng)度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。將愈傷組織接種在 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖 40 g/L+瓊脂 8.0 g/L 的培養(yǎng)基上，接種后分別放置在光照強(qiáng)度為0、800、1 600、2 400、3 200 lx 條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其他試驗(yàn)方法、步驟、測定項(xiàng)目同“1.2.1”。

1.2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響。將愈傷組織接種在 MS +蔗糖 40 g/L +瓊脂 8 g/L 的培養(yǎng)基中，激素添加情況見表 1。其他試驗(yàn)方法、步驟、測定項(xiàng)目同“1.2.1”。

1.2.5 TDZ濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。在培養(yǎng)基( MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖 40 g/L+瓊脂 8.0 g/L)中添加濃度分別為 0、0.025、0.050、0.075、0.10 mg/L 的TDZ，接入愈傷組織，其他試驗(yàn)方法、步驟、測定項(xiàng)目同“1.2.1”。

1.2.6 IBA濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。在培養(yǎng)基(MS+TDZ 0.05 mg/L+蔗糖 40 g/L+瓊脂 8.0 g/L)中添加濃度分別為 0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L 的IBA，接入愈傷組織，其他試驗(yàn)方法、步驟、測定項(xiàng)目同“1.2.1”。

表1 不同植物調(diào)節(jié)劑組合及用量 mg/L

1.3 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 11.5 和 Excell 軟件分析，顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時(shí)期對黑果腺肋花楸胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表2可知，當(dāng)取材時(shí)期為轉(zhuǎn)色期時(shí)，胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率為 68%，鮮重為 0.444 0 g，均顯著高于其他處理，且愈傷組織顏色為乳白色(圖1)，結(jié)構(gòu)致密；而取材時(shí)期為青果期和黑果期時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)頻率較低且組織結(jié)構(gòu)松散；因此選取轉(zhuǎn)色期為最佳取材時(shí)期。

表2 取材時(shí)期對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 培養(yǎng)基種類對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表3可知，當(dāng)接種在 MS 培養(yǎng)基上時(shí)，胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率為 81%，鮮重為 0.678 0 g，均顯著高于其他處理(除與WPM鮮重差異不顯著外)，愈傷組織顏色為乳白色，結(jié)構(gòu)致密； B5和White 中愈傷組織褐變現(xiàn)象明顯； WPM 中愈傷組織結(jié)構(gòu)較為松散，不利于進(jìn)一步培養(yǎng)(圖2)；因此選取 MS 作為最佳培養(yǎng)基。

2.3 光照強(qiáng)度對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表4可知，光照強(qiáng)度在 0～3 200 lx時(shí)，愈傷組織鮮重呈先增后減的趨勢，當(dāng)光照強(qiáng)度為 800 lx時(shí)，愈傷組織鮮重為 0.842 9 g，誘導(dǎo)率為89%，均高于其他處理，愈傷組織表面有不規(guī)則突起，結(jié)構(gòu)致密；隨著光照強(qiáng)度繼續(xù)增加，愈傷組織鮮重逐漸降低，顏色逐漸加深，表面均附著紅色(圖3)。因此選取 800 lx作為最適光照強(qiáng)度。

表3 培養(yǎng)基種類對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

光照強(qiáng)度∥lx誘導(dǎo)率%鮮重g緊致度顏色087a0.8285a致密乳白色80089a0.8429a致密綠色160082b0.8172a致密綠色略帶紅色240079c0.7723b致密綠色帶紅色320072d0.6592c致密綠色附著紅色

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表5可知，III、VIII、X培養(yǎng)基上產(chǎn)生的愈傷組織顏色為綠色或綠色附著白色，表面有不規(guī)則突起且組織結(jié)構(gòu)致密，有利于進(jìn)一步的器官分化，其中X號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率和鮮重分別為 91%和 858.3 mg，均達(dá)到最大值，優(yōu)于其他處理；且在添加2,4-D 1.0 mg/L 的IV、VIII和XII號(hào)培養(yǎng)基上產(chǎn)生的愈傷組織均部分呈水浸狀(圖4)；即最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合是TDZ和IBA。

2.5 TDZ濃度對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表6可知，TDZ濃度在0～0.100 mg/L時(shí)，愈傷組織鮮重呈先增后減的趨勢，緊致度也從松散向緊致變化，顏色逐漸加深(圖5)，當(dāng)TDZ濃度為 0.050 mg/L時(shí)，愈傷組織鮮重為 0.876 2 g，顯著高于其他處理，且愈傷組織顏色為綠色，結(jié)構(gòu)致密，表面有不規(guī)則突起，無褐變，有利于增殖及進(jìn)一步分化；當(dāng)TDZ濃度逐漸增加至 0.100 mg/L時(shí)，愈傷組織褐變現(xiàn)象明顯；因而，最有利于胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的TDZ濃度為 0.050 mg/L。

2.6 IBA濃度對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表7可知，當(dāng)IBA濃度在 0～4.0 mg/L時(shí)，愈傷組織鮮重呈先增后減的趨勢，其中當(dāng)IBA濃度為 2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織鮮重為0.892 8 g，高于其他處理，且愈傷組織顏色為淡黃色，結(jié)構(gòu)致密，表面有不規(guī)則突起(圖6)，有利于增殖及進(jìn)一步分化；當(dāng)IBA濃度增加至 4.0 mg/L時(shí)，愈傷組織褐變嚴(yán)重，趨于死亡；因此，適宜誘導(dǎo)胚乳愈傷組織的IBA濃度 2.0 mg/L。

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

表6 TDZ濃度對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的影響

IBA濃度mg/L誘導(dǎo)率%鮮重g緊致度顏色037c0.3257d松散綠色1.092a0.8745a致密綠色2.095a0.8928a致密黃綠色,附白色3.087b0.7783b致密黃綠色,附白色4.084b0.6419c致密褐色

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

取材時(shí)期不同，愈傷組織誘導(dǎo)率差異較大，可能與胚乳處于不同發(fā)育狀態(tài)有關(guān)[11]。誘導(dǎo)胚乳愈傷組織的基本培養(yǎng)基尤以 MS 最為常用；不添加任何激素或單獨(dú)添加細(xì)胞分裂素或生長素，即使能誘導(dǎo)出愈傷組織，也不能繼續(xù)正常生長，必須同時(shí)添加細(xì)胞分裂素或生長素，這與前人研究結(jié)果較為一致[12]；TDZ具有細(xì)胞分裂素的活性，可以促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)[13]；早期研究表明，暗培養(yǎng)有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，該研究表明光照條件下更適合胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)[14]。

綜上所述，適宜黑果腺肋花楸胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)方法為轉(zhuǎn)色期取材，光照強(qiáng)度為800 lx：培養(yǎng)基配方為 MS+TDZ 0.050 mg/L+IBA 2.0 mg/L+蔗糖 40 g/L +瓊脂 8 g/L。

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The Induction of Endosperm Callus ofAroniamelanocarpaElliot

LV Tian-shu， LI Shuang，GAO Fang-ke，WU Rong-zhe*

(Department of Horticulture and Landscape Architecture,Agricultural College of Yanbian University,Yanji,Jilin 133002)

[Objective] The aim was to study factors affecting the endosperm callus induction,in order to lay a foundation for triploid plant regeneration.[Method] The seeds ofAroniamelanocarpaElliot were used as experimental materials on this study to explore the influences of sampling time,different medium and hormone’s concentrations on endosperm callus induction.[Result]The experiments showed that endosperm inoculated on MS medium supplemented with 0.05 mg/L TDZ,2.0 mg/L IBA gave highest callus induction rate 92% .The callus was yellow green with a compact structure.[Conclusion]The suitable medium for the induction of endosperm callus ofAroniamelanocarpaElliot was MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 2.0 mg/L+40 g/L+sucrose AGAR 8 g/L with light intensity of 800 lx in turning green period .

AroniamelanocarpaEndosperm; Callus; Hormone; Sugar source

吉林省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(20140101218JC)。

呂天舒(1992- )，女，吉林磐石人,碩士研究生，研究方向：園藝植物生物技術(shù)。*通訊作者，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，從事生物工程及栽培生理等研究。

2015-04-22

S 188

A

0517-6611(2015)17-025-04