白念珠菌CaFIG1基因缺失突變株的構建

王雅楠，王軍軍，徐大勇，蔣伶活

(江南大學生物工程學院國家工程實驗室，江蘇無錫 214122)

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白念珠菌CaFIG1基因缺失突變株的構建

王雅楠，王軍軍，徐大勇，蔣伶活*

(江南大學生物工程學院國家工程實驗室，江蘇無錫 214122)

[目的]研究CaFIG1基因除參與有性生殖過程外，是否還參與細胞鈣穩(wěn)態(tài)等其他功能，對CaFIG1進行基因敲除。[方法]采用2種方法分別敲除CaFIG1的2個等位基因，一種通過PCR擴增HIS1敲除盒，另一種通過克隆的手段構建URA3敲除盒。[結果]從白念珠菌RM1000中成功敲除了CaFIG1雙等位基因。[結論]該敲除策略同樣適用于其他基因的敲除，提高了基因敲除的效率。

白念珠菌；CaFIG1；基因敲除

白念珠菌(Canidiaalbicans)是一種已知的條件致病菌，寄生于正常人體的皮膚粘膜，與其宿主免疫系統(tǒng)維持平衡的狀態(tài)[1]。白念珠菌是研究真菌致病性的重要模式生物，具有廣泛的科研應用價值。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的進步，白念珠菌的基因組測序工作已經(jīng)完成，尤其白念珠菌菌絲遺傳發(fā)育的機制已發(fā)展到全基因組水平。但白色念珠菌致病機理仍不完全清楚，因此，有必要從分子水平上對白念珠菌的基因功能進行深入研究，進一步研究白色念珠菌基因的表達、調(diào)控機制、發(fā)病機理及耐藥性，這有助于發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物。

在真核生物細胞中，鈣離子是最普遍且最重要的信號傳導分子。鈣離子不僅參與細胞內(nèi)多種基礎代謝反應，而且作為一種多功能的信號載體，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)各種生命活動[2-3]。細胞通過鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子含量，使細胞質(zhì)和細胞器中胞內(nèi)鈣離子濃度保持在穩(wěn)定水平[4]。研究表明，鈣離子信號傳導對白念珠菌的侵染能力以及壓力應答反應至關重要[5]。

白念珠菌質(zhì)膜上亦存在2種鈣吸收系統(tǒng)，包括高親和性鈣吸收系統(tǒng)(HACS，calcium-uptake system) 與低親和性鈣吸收系統(tǒng)(LACS，low-affinity calcium-uptake system)，兩者共同控制胞外鈣的內(nèi)流，維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)[6]。HACS由CaCch1-CaMid1-CaEcm7p 復合體組成。其中CaCch1p是HACS的催化亞基，CaMid1p為HACS的調(diào)節(jié)亞基，CaEcm7p為新發(fā)現(xiàn)的HACS的組成蛋白。LACS是另一種質(zhì)膜鈣轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，介導富鈣條件下外鈣內(nèi)流[7]。CaFig1p是目前唯一已知的LACS 成分。關于CaFig1p功能研究，已有文獻報道，在CIA4(ura3::λimm434/ura3::λimm434)背景下，CaFIG1基因的缺失能夠顯著抑制菌絲的重新定向以及交配保護下的細胞融合，但沒有發(fā)現(xiàn)CaFig1p參與細胞正常生長的作用[8]。然而通過蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，CaFig1p在很多生物體內(nèi)均存在同源蛋白，且這些蛋白都發(fā)揮著重要功能。如在釀酒酵母中，其同源蛋白ScFig1p蛋白具有促進鈣內(nèi)流的功能[9]；其在人體中也存在其同源蛋白PMP-22/EMP/MP20/Claudins，該蛋白與膜聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)運與組裝有關[10]。因此筆者以RM1000為背景菌，采用2種敲除的手段構建CaFIG1單基因缺失株，旨在研究CaFIG1基因除參與有性生殖過程外，是否還具有其同源蛋白所發(fā)揮的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物。供試菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

表1 試驗所用菌株和質(zhì)粒

注：未標于參考文獻的均來源于該研究。

1.1.2 主要試劑。基因克隆相關的限制性內(nèi)切酶、CIAP堿性磷酸酶、T4連接酶等購自寶生物大連有限責任公司；5-氟乳清酸(5-FOA)購自上海諾泰化工有限公司；轉(zhuǎn)化相關的醋酸鋰、聚乙二醇3350購自Sigma公司，ssDNA購自南京生興生物技術有限公司；TaqDNA聚合酶和大腸桿菌感受態(tài)細胞購自北京全式金公司；所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表2 試驗所用引物

1.1.3 主要儀器。PCR反應儀(德國艾本德公司)、全溫搖瓶柜(太倉強樂實驗設備廠)、臺式冷凍離心機(日本日立公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.1.4 培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g)。用1 mol/L NaOH溶液將其調(diào)pH至7.0，定容后121 ℃滅菌20 min。YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g)，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

SD-Ura培養(yǎng)基：酵母氮源1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，葡萄糖20 g/L，氨基酸mix 5.9 g/L，亮氨酸0.1 g/L，組氨酸0.02 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g)，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

SD-His培養(yǎng)基：酵母氮源1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，葡萄糖20 g/L，氨基酸mix 5.9 g/L，亮氨酸0.1 g/L，尿嘧啶0.02 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L)，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

SD-Ura-His培養(yǎng)基：酵母氮源1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，葡萄糖20 g/L，氨基酸mix 5.9 g/L，亮氨酸0.1 g/L(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g)，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

5-氟乳清酸(5-FOA)固體培養(yǎng)基：稱取0.1 g 5-FOA溶于提前預熱的30 ml雙蒸水中，過濾除菌后，加入到70 ml滅菌后未冷卻的YPD固體培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌基因組DNA的提取及鑒定。收集在SD-His或SD-Ura液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的菌液1.5 ml，12 000 r/min離心1 min，收集白念珠菌細胞，提取白念珠菌DNA[13]。以白念珠菌基因組DNA為模板，分別用相應的引物檢驗CaFIG1基因的敲除。用FIG1-DF和 HIS1-DR及FIG1-DR和HIS1-DF這2對引物驗證FIG1基因第一拷貝的敲除；用FIG1-ORF-UP和FIG1-ORF-DOWN，F(xiàn)IG1-DF和 HisG-DR及FIG1-DR和HisG-DF這3對引物驗證FIG1基因第二拷貝的敲除。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 質(zhì)粒DNA的制備。將雙酶切過的載體p5921和同源片段CaFIG1-L或同源片段CaFIG1-R按一定比例連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1，挑取克隆轉(zhuǎn)化子接種于3 ml氨芐終濃度為50 ng/ml的LB+Amp液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min恒溫搖床振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中10 000 r/min離心1 min，棄去上清。將菌體充分重懸于100 μl的堿I裂解液中。同時配制新鮮的堿Ⅱ裂解液(1 ml配方：880 μl ddH2O2，20 μl 10 mol/L NaOH，100 μl 10% SDS)，重懸充分后，加入200 μl的堿Ⅱ裂解，溫和顛倒混勻5次，菌液變澄清。立即加入150 μl預冷的堿III裂解液，溫和顛倒20次左右，有絮狀沉淀產(chǎn)生。4 ℃下12 000 r/min離心10 min。用移液槍吸取400 μl的上清液至新的EP管中，同時加入400 μl酚/氯仿/異戊醇，充分振蕩混合后，4 ℃，12 000 r/min離心10 min。EP管中菌液分層，將上清液移入新EP管中(注意不要吸到白色界面)，加入35 μl 3 mol/L NaAc，700 μl無水乙醇，顛倒混合后，-80 ℃放置20 min。12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液。加入500 μl 75%乙醇，洗滌沉淀，吸干殘液，55 ℃干燥15 min左右至液體揮發(fā)完全。加入20 μl無菌水配制的200 μg/ml RNase水，55 ℃消化RNA 30 min。最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA濃度。

2 結果與分析

2.1HIS1敲除盒的構建 以質(zhì)粒pFA-HA-HIS1為模板，F(xiàn)IG1-HIS1-UP及FIG1-HIS1-DOWN為上下游引物，PCR擴增HIS1敲除盒。其理論條帶大小應為1.8 kb。經(jīng)過10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，PCR擴增獲得片段和理論預計大小相符，說明經(jīng)PCR擴增獲得正確的CaFIG1基因敲除盒。

2.2URA3敲除盒的構建 采用克隆的手段構建URA3敲除盒。以質(zhì)粒p5921為載體，將CaFIG1基因的同源片段L及R連接到載體質(zhì)粒 p5921上hisG-URA3-hisG兩側(cè)相應酶切位點，構建了可以重復利用的敲除盒質(zhì)粒pWC。構建示意見圖2。

用引物FIG1-L-F和FIG1-L-R通過PCR擴增出帶有SacI和KpnI 2個酶切位點的同源臂CaFIG1-L(圖3A)。再用SacI/KpnI雙酶切載體p5921及同源片段CaFIG1-L，運用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物后，將載體p5921和同源片段CaFIG1-L按照一定比例進行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。對獲得轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒后，用SacI/KpnI雙酶切驗證質(zhì)粒p5921(作為負對照)及克隆轉(zhuǎn)化子驗證是否連接上同源片段CaFIG1-L。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖3B，將正確的轉(zhuǎn)化子命名為pWC1。

在質(zhì)粒pWC1的基礎上用同樣的方法連接同源片段CaFIG1-R，同理，用引物FIG1-R-F和引物FIG1-R-R通過PCR擴增出帶有PstI，BamH I這2個酶切位點的同源臂CaFIG1-R(圖3A)。用PstI和BamH I同時雙酶切質(zhì)粒pWC1及同源片段CaFIG1-R，酶切產(chǎn)物純化后，將兩者按照一定比例進行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。對獲得轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒后，用PstI/BamH I雙酶切驗證質(zhì)粒p5921(作為負對照)及克隆轉(zhuǎn)化子驗證是否連接上同源片段CaFIG1-R。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖3C，將正確的轉(zhuǎn)化子命名為pWC。

最后，用SacI/PstI線性化敲除盒質(zhì)粒pWC，即獲得了待轉(zhuǎn)化用的URA3敲除盒。電泳檢測結果見圖3D。

2.3CaFIG1基因第一拷貝的敲除與鑒定 以實驗室已有的野生型菌株RM1000為背景，敲除CaFIG1基因。用HIS1敲除組件敲除CaFIG1基因的第一拷貝。采用醋酸鋰方法[14]，將4 ugCaFIG1基因敲除組件HIS1轉(zhuǎn)化白念珠菌RM1000細胞，取適量轉(zhuǎn)化菌液涂布于SD-His固體培養(yǎng)基上，30 ℃，培養(yǎng)2～3 d至單菌落出現(xiàn)。將獲得的單菌落在SD-His固體培養(yǎng)基純化后，接單菌落于3 ml SD-His液體培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集細胞，提取基因組驗證。以基因組為模板，用FIG1-DF和HIS1-DR及FIG1-DR和HIS1-DF這2對引物，退火溫度均為53 ℃，延伸時間1.5 min，驗證CaFIG1基因第一拷貝的敲除。正確敲除掉CaFIG1基因第一拷貝的菌株命名為WYCA-1，用10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖4。

2.4CaFIG1基因第二拷貝的敲除與鑒定 在敲除掉CaFIG1基因第一拷貝的基礎上，用URA3敲除盒敲除CaFIG1基因的第二拷貝。采用醋酸鋰方法[14]，將4 μgURA3敲除盒轉(zhuǎn)化白念珠菌WYCA-1細胞，取適量轉(zhuǎn)化菌液涂布于SD-Ura-His固體培養(yǎng)基上，30 ℃，培養(yǎng)2～3 d至單菌落出現(xiàn)。將獲得的單菌落在SD-Ura-His固體培養(yǎng)基純化后，接單菌落于3 ml SD-Ura-His液體培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集細胞，提取基因組驗證。以基因組為模板，首先用FIG1-ORF-UP和FIG1-ORF-DOWN驗證CaFIG1基因的ORF是否還存在，在CaFIG1基因ORF不存在的基礎上，用FIG1-DF和HisG-DR及FIG1-DR和HisG-DF這2對引物驗證，退火溫度均為53 ℃，延伸時間1.5 min。將正確敲除掉CaFIG1基因第二拷貝但帶有Ura+標記的菌株命名為WYCA-2。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖5。

最后需要通過hisG片段重組去除URA3基因，選取WYCA-2菌株的轉(zhuǎn)化子涂布于5-FOA平板上，培養(yǎng)3～5 d后長出單菌落。得到單菌落后，再挑取這些單菌落，分別劃線于含有0.1%5-氟乳清酸的YPD平板及YPD平板上進行純化，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d長出單菌落。能在YPD平板上生長但在含有0.1% 5-氟乳清酸的YPD平板上不生長的單菌落，可能利用了2個hisG片段的順勢重組除去了URA3基因。然后將其接種于YPD液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，提取基因組，進行PCR驗證。以基因組為模板，F(xiàn)IG1-DF和 HisG-DR及FIG1-DR和HisG-DF這2對引物驗證，退火溫度均為53 ℃，延伸時間均為1.5 min。用10 g/ml瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖6。

3 結論與討論

該研究采用2種不同的敲除策略，在RM1000背景下成功構建了白念珠菌CaFIG1雙等位基因缺失株，為CaFIG1基因功能的研究奠定了基礎。首先，以PCR為基礎的基因敲除技術，構建HIS1敲除盒，敲除白念珠菌CaFIG1基因的一個拷貝。其次，通過克隆的手段，將CaFIG1基因的2個同源片段，分別連接到載體質(zhì)粒 p5921的hisG-URA3-hisG兩側(cè)相應酶切位點，構建了可以重復利用的敲除盒質(zhì)粒pWC。將其線性化后獲得了URA3敲除盒，用于敲除CaFIG1基因的另一個拷貝。

與傳統(tǒng)的基因敲除方法相比，使用2種不同的敲除策略，通過2個篩選標記，降低了在敲除基因第二拷貝時敲除盒替換第一拷貝的概率，實現(xiàn)目的基因的準確敲除。且依據(jù)基因的同源重組效率主要依賴于基因敲除組件提供的同源區(qū)域片段大小[15]，通過用長引物進行PCR擴增可以獲得較長側(cè)翼同源區(qū)域序列的敲除盒，有效地提高了同源重組的效率。這種基因敲除的策略為基因的敲除提供了一種新的思路與方法。

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Construction ofCaFIG1 Gene Deletion Mutant inCanidiaalbicans

WANG Ya-nan, WANG Jun-jun, XU Da-yong, JIANG Ling-huo*

(National Engineering Laboratory, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

[Objective] The aim was to constructCaFIG1 gene deletion mutant inCanidiaalbicanstostudythe additional functions ofCaFIG1 gene,such as participate in the regulation of cell calcium homeostasisits besides in mating. [Method] Two methods were adopted to knockout two alleles ofCaFIG1 gene. One wasHIS1 knockout cassette by PCR, the other wasURA3 knockout cassetteby clone. [Result] The study successfully knockout two alleles ofCaFIG1 gene inC.albicansstrains RM1000. [Conclusion] This knockout strategy was also applicable to knockoutother gene, and it would improve the efficiency of gene knockout.

Canidiaalbicans;CaFIG1; Knockout

國家自然科學基金項目(81371784)；江南大學自主研究計劃重點項目(JUSRP51313B)。

王雅楠(1989-)，女，河南駐馬店人，碩士研究生，研究方向：酵母遺傳學與分子生物學。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事酵母和絲狀真菌遺傳學與分子生物學研究。

2015-04-22

S 188

A

0517-6611(2015)17-043-04