SAS正交設(shè)計篩選通關(guān)藤組培誘導(dǎo)培養(yǎng)基的研究

韓 俊，楊生超，王自林，黃 鶴

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 6502010)

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SAS正交設(shè)計篩選通關(guān)藤組培誘導(dǎo)培養(yǎng)基的研究

韓 俊，楊生超，王自林，黃 鶴

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 6502010)

[目的]篩選最佳的通關(guān)藤誘導(dǎo)培養(yǎng)基。[方法]以紅河通關(guān)藤當(dāng)年新生枝的頂芽與莖段作為外植體，在光照時間12 h/d、光照強(qiáng)度2 000 lx、溫度(25±2)℃、pH為5.8培養(yǎng)條件下,采用SAS正交設(shè)計比較不同基本培養(yǎng)基, 細(xì)胞分裂素、生長素和不同部位的外植體對外植體芽的誘導(dǎo)率和新芽生長狀況的影響。[結(jié)果]誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳的配方為MS+瓊脂 7g/L+蔗糖25 g/L +6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。[結(jié)論]該研究為通關(guān)藤的快速繁殖提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

通關(guān)藤；SAS正交設(shè)計；組織培養(yǎng)；培養(yǎng)基篩選

通關(guān)藤(Marsdeniatenocissima(Roxb) Wight et Arm)為蘿藦科牛奶菜屬藤本植物，又名烏骨藤，始載于《滇南本草》，廣泛分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。其全株均具有清熱解毒、消炎止痛和止咳平喘之功效[1]。通關(guān)藤所含的烏骨消癌素(C21- 甾體甙和烏骨總堿)對癌細(xì)胞分裂的根源 - 微管排列有很強(qiáng)的破壞作用，可阻斷癌細(xì)胞的有絲分裂，從而有效切斷癌細(xì)胞擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移，癌癥因此萎縮直至完全消失[2]。可用于晚期肺癌[3]、急性白血病[4]、食管癌[5]、胃癌[6]、肝癌[7]等各種晚期惡性腫瘤的治療，以通關(guān)藤為主要原料制備而成的中藥消癌平制劑[8]，療效良好。

通關(guān)藤主要來源自然繁殖和有限的野生資源。由于其自身花多果少的生物特性，植物自然繁殖力低。加之，高強(qiáng)度的砍伐采收，致使當(dāng)前通關(guān)藤野生資源量急劇減少，人工繁育或栽培勢在必行。優(yōu)質(zhì)種苗的快速獲取是通關(guān)藤栽培最為關(guān)鍵的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。而通關(guān)藤種子繁殖得到的實生苗，品種極容易退化，且生長周期長，結(jié)實率低；其次扦插繁殖雖然成活率高，但后期感病嚴(yán)重，作為中藥材這種特殊的商品，很難滿足藥業(yè)市場的需求。因此，探索一種適宜規(guī)模化生產(chǎn)的、繁殖快的、抗性好的通關(guān)藤無菌優(yōu)質(zhì)組培苗的方法，對保證通關(guān)藤原料藥材的持續(xù)供應(yīng)具有重要的意義。目前，通關(guān)藤的研究主要集中于植物有效成分及其藥理作用方面，尚無通關(guān)藤組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)方面的研究報道。因此該研究采用SAS軟件設(shè)計了不同基本培養(yǎng)基、不同外植體部位、NAA與6-BA多濃度水平的多因素正交試驗,研究不同處理對通關(guān)藤莖尖頂芽與莖段側(cè)芽的誘導(dǎo)分化及芽生長狀況的影響,從中篩選出最適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,為通關(guān)藤的快速繁殖提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 由云南紅河圣和植物藥業(yè)有限公司提供的通關(guān)藤，經(jīng)栽培馴化后，選擇各項生長指標(biāo)較優(yōu)的單株作為研究試驗材料。

1.2 無菌材料的建立 于晴天午后，剪取優(yōu)株莖尖作為外植體，按常規(guī)滅菌程序滅菌，用流水沖洗2～3 h,再用5%洗衣粉水浸泡3～5 min后用流水沖洗20～25 min，再經(jīng)無菌水清洗3遍后在無菌條件下進(jìn)行以下操作：用75%乙醇溶液浸泡0.5 min，然后用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min,再用無菌水洗滌5～6 次后，瀝干消毒好的外植體，去除莖上幼葉, 將莖段剪成約1 cm長，分別接種在9個處理中,采用4因素3水平的正交試驗設(shè)計L9(34)安排試驗(表1),每個處理設(shè)5次重復(fù),每瓶接種3個外植體。以探索不同培養(yǎng)基、接種不同部位的外植體和不同濃度激素對通關(guān)藤(頂芽與側(cè)芽)誘導(dǎo)率和新芽生長狀況(平均莖粗與平均莖高)的影響。50 d后觀察并記錄試驗數(shù)據(jù)，如H(平均芽粗)、I(平均芽高)、J(誘導(dǎo)率),并采用SAS軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

1.3 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基中加入瓊脂 7.1 g/L、蔗糖25 g/L，pH 5.8。培養(yǎng)光照時間12 h/d,光照強(qiáng)度2 000 lx,溫度控制在(25±2)℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅河通關(guān)藤組培苗生長習(xí)性 在組織培養(yǎng)中，紅河通關(guān)藤的莖尖與莖段的生長及分化需要較長的時間,一般要在12～15 d才能用肉眼觀察出變化。莖尖的莖節(jié)部早期長出黃綠色的小芽, 隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸轉(zhuǎn)為綠色,芽逐漸變粗長高,其上有新的小葉片與小芽長出，隨后葉片向上舒張開，逐漸長大。在整個培養(yǎng)過程中偶然可見到部分莖段的莖節(jié)處有新的淡綠色膨大如圓團(tuán)狀的愈傷組織產(chǎn)生,但一直沒有見到愈傷組織分化出來的新芽。因此，筆者獲取通關(guān)藤小植株是通過對其莖尖與莖段的頂芽和側(cè)芽進(jìn)行誘導(dǎo)芽叢和小植株而得。

2.2 SAS正交設(shè)計篩選通關(guān)藤組培誘導(dǎo)培養(yǎng)基

2.2.1 方差分析。方差分析結(jié)果表明，培養(yǎng)基(A)、6-BA(B)、NAA(C)、外植體(D)對誘導(dǎo)生長出的芽粗、芽高和芽誘導(dǎo)率均存在極顯著的相關(guān)性，A、B、C對芽粗、芽高和芽誘導(dǎo)率的生長影響均比較大，D的影響最小；A、B、C、D 4個因子的主效應(yīng)差異均達(dá)到極顯著水平，即每個因子的各個水平間在平均芽粗、平均芽高、誘導(dǎo)率上存在極顯著差異，且4個因子對通關(guān)藤芽生長狀況的平均芽粗、平均芽高和芽誘導(dǎo)率影響大小依次是A>B>C>D。

2.2.2 主效應(yīng)多重比較，選出各因素的最優(yōu)水平組合。因為該試驗設(shè)計了4個因素，每個因素分3個水平，經(jīng)方差分析結(jié)果顯示，每個因子的各個水平間在平均芽粗、平均芽高、誘導(dǎo)率上均存在極顯著差異，因此進(jìn)一步對每個因子的多重比較具有了統(tǒng)計學(xué)意義，可從各因素水平間的多重比較中選出各因素的最優(yōu)水平組合。從主效應(yīng)的多重比較(表1)可以看出，在A的3個水平中，A2水平對平均芽粗、平均芽高和誘導(dǎo)率的影響極顯著高于A1和A3，即A2是最好的水平；在B的3個水平中，B2水平對誘導(dǎo)率的影響極顯著高于B3和B1，即B2是最好的水平；在C的3個水平中，C3水平對誘導(dǎo)率的影響極顯著高于C2和C1，即C3是最好的水平；在D的3個水平中，D2、D3水平對誘導(dǎo)率的影響極顯著高于D1，即D2和D3之間差異不顯著。導(dǎo)致這樣的結(jié)果可能有2個方面的原因：一是D的水平間的極差過小，尤其是D2和D3之間的極差過小；二是D的水平提高到了D2已經(jīng)到了對誘導(dǎo)率影響的極限，進(jìn)一步提高D因子的水平對誘導(dǎo)率的影響已經(jīng)意義不明顯。

2.2.3 處理間效應(yīng)的多重比較。方差分析結(jié)果顯示處理間效應(yīng)差異極顯著，各個處理間對誘導(dǎo)率影響的多重比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，可從各處理間找出最優(yōu)組合。從處理間效應(yīng)的多重比較(表1)可以看出，第5個(A2B2C3D1)處理對誘導(dǎo)率和芽生長的影響極顯著高于其他處理，其次是第4個處理，再次是第6個處理。綜合4個因子主效應(yīng)的多重比較及處理間效應(yīng)的多重比較結(jié)果，A2B2C3D1是相對比較理想的組合方式，不僅處理間效應(yīng)高，且A、B、C的主效應(yīng)也高，但在這一組合方式中D的主效應(yīng)不高。

表1 正交設(shè)計試驗方案及試驗結(jié)果 (n=9)

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示處理間差異顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

該試驗采用紅河通關(guān)藤當(dāng)年新生枝作為外植體，研究在不同培養(yǎng)基(B5、MS和1/2MS)、不同激素(6-BA、NAA)和不同莖段部位(莖尖、莖中和莖基)對外植體芽的誘導(dǎo)率和新芽生長狀況(芽粗和芽高)的影響。結(jié)果表明，在光照時間為12 h/d、光照強(qiáng)度為2 000 lx、溫度為(25±2)℃、pH為5.8培養(yǎng)條件下，MS培養(yǎng)基最適宜通關(guān)藤的頂芽與側(cè)芽的誘導(dǎo)和生長，1/2MS培養(yǎng)基對通關(guān)藤的誘導(dǎo)培養(yǎng)次之，B5培養(yǎng)基對通關(guān)藤頂芽和側(cè)芽的誘導(dǎo)率以及芽生長狀況影響最小。在0.1～0.5 mg/L NAA時對紅河通關(guān)藤頂芽與側(cè)芽的誘導(dǎo)和生長均有不同程度的促進(jìn)，NAA對芽的誘導(dǎo)率和新芽生長狀況的影響作用是隨著質(zhì)量濃度的增加而增加的，可見NAA在低質(zhì)量濃度時對紅河通關(guān)藤所表現(xiàn)出來的激素效應(yīng)就很明顯。6-BA在1.5～2.5 mg/L時其促進(jìn)芽的誘導(dǎo)分化和生長的效果呈極顯著，說明紅河通關(guān)藤對6-BA具有較高的質(zhì)量濃度耐受性。6-BA在1.5～2.0 mg/L時其促進(jìn)頂芽與側(cè)芽誘導(dǎo)分化和芽生長的作用是隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，在2.0～2.5 mg/L時其促進(jìn)頂芽與側(cè)芽誘導(dǎo)分化和芽生長的作用是隨著質(zhì)量濃度的增加而減小。由此可知，在采用MS培養(yǎng)基、莖中作為外植體，NAA 0.5 mg/L與6-BA 2.0 mg/L組合時對紅河通關(guān)藤頂芽與側(cè)芽的誘導(dǎo)分化和芽生長效果最顯著，即誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳的配方為MS+瓊脂 7 g/L+蔗糖25 g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

從該試驗看出，正交試驗是篩選最佳試驗方案的一個十分有效的工具，該試驗采用L9(34)正交設(shè)計試驗的方法，用較少的9個試驗處理組合來優(yōu)化篩選出誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳配方，效率較高。只是在今后研究紅河通關(guān)藤的組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及后續(xù)的增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)時，可以將植物激素的濃度水平范圍適當(dāng)放寬，從而獲得最為理想的培養(yǎng)配方。

[1] 成冠藍(lán),孔令義,張倉.通關(guān)藤化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)與臨床研究,2009,17(2):123-137.

[2] 李東,歐陽建,李翠萍,等.通關(guān)藤對U937細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)譜的影響[J].中國生化藥物雜志,2008,29(4):240-243.

[3] 劉榮成.消癌平注射液治療晚期肺癌療效觀察[J].宜春學(xué)院學(xué)報,2003,25(5):86.

[4] 李東,歐陽建,李翠萍,等.消癌平注射液對白血病細(xì)胞NB4作用的初步研究[J].中國生化藥物雜志,2007,28(4):247-250.

[5] 張明智,何振,吳廣銀,等.消癌平對 EC-9706食管癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008,19(5):1182.

[6] 袁秀英.范忠澤,黃秀英.消癌平注射液治療14例晚期胃癌的臨床觀察[J].上海醫(yī)藥,1996(6):15-16.

[7] 山廣志,劉文奇.消癌平注射液經(jīng)肝動脈介入治療原發(fā)性肝癌20例[J].臨床腫瘤雜志,2006,11(9):713-714.

[8] 石濤.消癌平注射液臨床應(yīng)用1009例分析[J].江蘇醫(yī)藥,2012,38(9):1109-1110.

Study on Screening by SAS Orthogonal Design in Induction Medium of Tissue Culture forMarsdeniatenacissima

HAN Jun, YANG Sheng-chao, WANG Zi-lin et al

(Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201)

[Objective] The study aimed to screen the optimum induction medium of tissue culture forMarsdeniatenacissima.[Method] The tissue culture of the stem segment and terminal bud of new growing branch of HongheMarsdeniatenacissimawere taken as the explant for induction medium compared by SAS orthogonal design of the effects, such as different basic culture medium cytokinin, growth hormone and the explant of different parts, on the growth ofMarsdeniatenacissimaunder the culture conditions of light time of 12 h/d, light intensity of 2 000 lx and temperature of (25±2)℃ and pH of 5.8.[Result] The optimum for induction medium of tissue culture forMarsdeniatenacissimais MS+ agar 7 g/L+ sucrose 25 g/L+NA A0.2 mg/L+6-BA 2 mg/L.[Conclusion] The study can provide theoretical basis and technical support for rapid propagation ofMarsdeniatenacissima.

Marsdeniatenacissima; SAS orthogonal design; Tissue culture; Medium screening

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)與圣和集團(tuán)云南圣和植物藥業(yè)有限公司(全額支助)的橫向課題(20130306)。

韓俊(1972-)，女，云南硯山人，講師，碩士，從事中藥的功用及藥用植物的生理生化研究。

2015-04-15

S 567

A

0517-6611(2015)14-098-02