6種云杉屬植物花粉活性測定

劉禹廷，藍登明*，余偉蒞，劉平生，趙 麗

(1.內蒙古農業大學生態環境學院，內蒙古呼和浩特 010019；2.內蒙古林業科學研究院，內蒙古呼和浩特 010019)

?

6種云杉屬植物花粉活性測定

劉禹廷1，藍登明1*，余偉蒞2，劉平生2，趙 麗2

(1.內蒙古農業大學生態環境學院，內蒙古呼和浩特 010019；2.內蒙古林業科學研究院，內蒙古呼和浩特 010019)

以引種栽培30～40年云杉樹種為研究對象，通過對花粉進行生活力測定，從而分析并探討引種云杉繁殖能力對環境的適應性特征，為今后開展雜交育種工作提供理論依據。文章采用4種花粉活性測定方法對6種云杉花粉進行活性測定試驗，得出以下結果：4種方法中，I2-KI染色法和醋酸洋紅染色法染色效果不佳，TTC染色法和離體培養法試驗效果較好，用TTC染色法和離體培養法對花粉進行活性測定，花粉活性均表現為白扦活性最高，粗枝云杉活性最低，且不同云杉花粉最適培養基中蔗糖濃度不同，多數以15 g/ml的蔗糖濃度萌發效果最好，而青海云杉以10 g/ml的蔗糖濃度萌發效果最佳。6種云杉花粉最適培養基中硼酸濃度均為0.05 g/ml。

云杉花粉；活性；測定方法

云杉(Picea)為松科常綠喬木，全世界有42種14變種，主要分布于北溫帶[1]。我國有18種7變種，另引種栽培2種[2]，是云杉屬樹種最多的國家[3]。該屬樹種生態適應性強，耐陰、耐寒、耐干旱，其木材品質好、用途廣，是北方地區重要的城市綠化和用材樹種[4]。

20世紀70、80年代，為了豐富內蒙古呼和浩特地區云杉樹木種類，增大該地區的生態和經濟效益[5]，內蒙古林業科學研究院先后將國內外多種云杉引種到樹木園[6]，至今已有30～40年的引種時間。為了探究引種云杉對環境的適應性特征，以其繁殖能力作為評定引種樹木適應性強弱的主要指標。針對這一指標了解到，在自然授粉情況下，引種云杉結實率很低[7]，因此對云杉花粉萌發、生長、發育等生活力指標進行測定[8]，為人工輔助授粉及雜交授粉提供參考依據，從而提高引種云杉的結實率和育種效率。花粉生活力測定方法一般包括染色法、離體培養法和花粉授粉結實檢測法等[9]。該試驗采用I2-KI染色法[9]、醋酸洋紅染色法[10]、TTC染色法[11]和離體培養法[12-13]這4種方法，對6種云杉屬植物花粉進行活性測定，旨在為云杉雜交育種和進一步花粉研究提供依據[14]。

1 材料與方法

1.1 供試材料 選取內蒙古林業科學研究院樹木園內生長狀況良好的引種云杉為試驗樹種，其中包括青海云杉(PiceacrassifoliaKom.)、歐洲云杉[P.abies(L.) Karst.]、白扦(P.meyeriRehd.ex Wils)、鱗皮云杉(P.retroflexaMast. )、紫果云杉(P.purpureaMast.)和粗枝云杉(P.asperataMast.)，引進樹種及種源如表1所示。在2014年6月10號前后分別摘取雄花數枚，經過充分自然干燥后進行試驗。

表1 樹木園引進樹種及種源

1.2 研究方法

1.2.1 花粉萌發率測定方法。

1.2.1.1 離體培養法測定云杉屬植物花粉萌發率。按表2所示計量配置培養基[15]，將配好的培養基和所需玻璃培養皿放在高溫滅菌鍋中滅菌，2.5 h后將培養皿取出，與試驗器材一同放置在紫外燈下滅菌15 min。再將未凝固的培養基均勻涂抹在載玻片上，用毛筆在培養基上撒開花粉，放進有濕潤濾紙的培養皿中，在25 ℃的恒溫箱中培養15～48 h，期間用顯微鏡觀察花粉萌發情況。以花粉管長度≥花粉粒短徑的1/2記為萌發，每種云杉花粉進行3次重復，拍照統計其萌發率[16]。

表2 L9(34)因素水平 g/ml

1.2.1.2 萌發率計算公式。萌發率=萌發的花粉數/觀察花粉總數×100%

1.2.2 染色法測定花粉活性。

1.2.2.1 TTC染色法測定云杉屬植物花粉活性。配置pH為7.0的磷酸緩沖液，取10 ml，將0.01 g的TTC溶于磷酸緩沖液中，充分搖勻。用毛筆將花粉在載玻片上輕輕撒開，滴加1～2滴配置好的TTC溶液，蓋上蓋玻片，放入濕潤濾紙培養皿中，在35 ℃的恒溫箱中放置30～60 min，用顯微鏡觀察染色情況。花粉被染成紅色，代表其具有活性，每種云杉花粉進行3個重復，拍照統計。

1.2.2.2 I2-KI染色法測定云杉屬植物花粉活性。將配好后的I2-KI溶液置于棕色瓶中。用毛筆將花粉在載玻片上輕輕撒開，滴加1～2滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片,然后在顯微鏡下檢查5個視野。花粉被染成藍色，代表其具有活性；花粉被染成黃褐色，代表其不具有活性。每種云杉花粉進行3個重復，拍照統計。

1.2.2.3 醋酸洋紅染色法測定云杉屬植物花粉活性。在100 ml濃度為45%的冰醋酸溶液中加入1 g洋紅粉末，并置于火源加熱，同時攪拌直到沸騰取出，待冷卻后加入1～2滴濃度2%的鐵明礬，然后過濾2～3次，裝入棕色瓶。用毛筆將花粉在載玻片上輕輕撒開，滴加1～2滴配置好的醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片，1～2 min后，置于顯微鏡下檢查5個視野。花粉被染成紅色，代表其具有活性。每種云杉花粉進行3個重復，拍照統計。

1.2.2.4 花粉活性計算公式。花粉活性=視野內被染色的花粉數/視野內花粉總數×100%

2 結果與分析

2.1 不同染色方法對6種云杉花粉活性的影響

2.1.1 I2-KI染色法對云杉花粉活性的影響。用I2-KI染色法對6種云杉花粉的活性進行測定，大多花粉呈現黃褐色(圖1，圖中顯示為黑色花粉管)，有些花粉無色(圖中顯示為淺灰色花粉管)，但沒有藍色反應，染色效果不理想，不能對云杉花粉進行有效的統計，說明I2-KI染色法不適用于云杉花粉活性試驗。

2.1.2 醋酸洋紅染色法對云杉花粉活性的影響。在醋酸洋紅染色法測定6種云杉花粉活性的試驗中，花粉幾乎沒有顯色反應，只有2～3粒花粉呈現淺粉色(圖2，圖中顯示為黑色花粉管)，其余花粉均沒有顏色反應(圖中顯示為白色花粉管)，不能有效證明花粉是否有活性，因此醋酸洋紅染色法在對云杉花粉染色試驗中不適用。

2.1.3 TTC染色法對云杉花粉活性的影響。在TTC染色法測定6種云杉花粉活性的試驗中，染色效果明顯，有活性的花粉，其花粉呈現紅色或粉色(圖3，圖中顯示為黑色花粉管)，無活性的花粉其花粉無色(圖中顯示為淺灰色花粉管)，顏色差異明顯，由統計結果可知TTC染色法可對云杉花粉進行染色試驗。

2.2 不同培養基對6種云杉花粉萌發率的影響 用離體培養法對云杉花粉進行體外培養，6種云杉花粉的花粉管萌發狀態差異明顯，花粉管長度≥花粉粒短徑的1/2為萌發,代表花粉有活性，相反則代表沒有活性(圖4)。

通過運用直觀分析法對表3～6進行統計分析可知，白扦、紫果云杉、歐洲云杉和鱗皮云杉9個培養基中，均為7號培養基試驗效果最佳，花粉萌發率最高。按因素水平來看，萌發率越大越好，故應選取使指標大的水平，即A因素列：k3>k1>k2；B因素列：k1>k3>k2；C因素列：k2>k3>k1。對于極差R值的比較，可以看出試驗因素存在的顯著性順序為B>A>C，因此白扦、紫果云杉、歐洲云杉和鱗皮云杉花粉萌發的優方案為B1A3C2，即蔗糖濃度15 g/ml，硼酸濃度0.05 g/ml，瓊脂濃度1.0 g/ml為最佳配比方案。

表3 白扦花粉萌發率正交試驗結果

表4 紫果云杉花粉萌發率正交試驗結果

由表7可知，在粗枝云杉9個培養基中，7號培養基試驗效果最佳，花粉萌發率最高。按因素水平來看，A因素列：k3>k2>k1；B因素列：k1>k2>k3；C因素列：k3>k1>k2。對于極差R值的比較，試驗因素存在的顯著性順序為B>A>C，因此粗枝云杉花粉萌發的優方案為B1A3C3，即蔗糖濃度15 g/ml，硼酸濃度0.05 g/ml，瓊脂濃度1.5 g/ml為最佳配比方案。

表5 歐洲云杉花粉萌發率正交試驗結果

表6 鱗皮云杉花粉萌發率正交試驗結果

表7 粗枝云杉花粉萌發率正交試驗結果

由表8可知，青海云杉以4號培養基花粉萌發率最高。按因素水平來看，A因素列：k2>k1>k3；B因素列：k1>k2>k3；C因素列：k1>k2>k3。對于極差R值的比較，試驗因素存在的顯著性順序為B>A>C，因此青海云杉花粉萌發的優方案為B1A2C1，即蔗糖濃度10 g/ml，硼酸濃度0.05 g/ml，瓊脂濃度0.5 g/ml為最佳配比方案。

表8 青海云杉花粉萌發率正交試驗結果

2.3 同種測定方法下6種云杉屬植物花粉活性比較 對TTC染色試驗中6種花粉活性統計可得圖5。由圖5可知，白扦花粉活性最高，活性最低的為粗枝云杉。活性最低的花粉與活性最高的花粉其花粉活性相差27.5個百分點。不同云杉花粉活性依次為：白扦花粉活性>青海云杉花粉活性>紫果云杉花粉活性>歐洲云杉花粉活性>鱗皮云杉花粉活性>粗枝云杉花粉活性。

圖6為離體培養法測定的6種云杉花粉萌發率統計圖。選取每種花粉9個培養基中萌發率最大值，作為該云杉樹種最佳萌發狀態下的萌發率。將6種云杉萌發率進行比較分析可得，白扦花粉萌發率最高，粗枝云杉花粉萌發率最低，二者花粉萌發率相差35.57個百分點，差異極顯著。不同云杉花粉萌發率依次為：白扦花粉萌發率>紫果云杉花粉萌發率>青海云杉花粉萌發率>歐洲云杉花粉萌發率>鱗皮云杉花粉萌發率>粗枝云杉花粉萌發率。

由于青海云杉和紫果云杉花粉在這2種活性測定方法中所表現出的活性大小順序不同，因此利用SPSS對這2種云杉花粉活性進行單因素方差分析，結果顯示二者無顯著性差異，說明青海云杉和紫果云杉花粉活性在同一水平。

對離體培養法和TTC染色法進行相關性分析，結果見表9。由表9可知，這2種花粉活性測定方法呈正相關性，且相關性極強。相關系數為0.958，決定系數為91.78%，表明離體培養法方差的91.78%可以用TTC染色法來解釋。說明離體培養法測定云杉花粉活性較高時，TTC染色法測定云杉花粉活性也較高，因此在云杉花粉活性測定的試驗中，可以選擇試驗步驟較簡單的TTC染色法代替離體培養法對其進行活性測定。

表9 離體培養法與TTC染色法相關性分析

注：*表示在0.01水平上顯著相關。

3 結論

(1)在4種花粉活性測定方法中，I2-KI染色法和醋酸洋紅染色法對6種云杉花粉均沒有明顯的色差反應。TTC染色法與離體培養法活性測定情況較好。

(2)6種云杉最適培養基中硼酸濃度為0.05 g/ml萌發效果最好。白扦、紫果云杉、歐洲云杉、鱗皮云杉和粗枝云杉培養基中蔗糖最適濃度為15 g/ml，而青海云杉為10 g/ml。青海云杉培養基中瓊脂最適濃度為0.5 g/ml，白扦、紫果云杉、歐洲云杉、鱗皮云杉為1.0 g/ml，粗枝云杉為1.5 g/ml。

(3)通過對6種云杉花粉進行活性檢測，反映出花粉活性大小依次為：白扦花粉活性、青海云杉花粉活性、紫果云杉花粉活性、歐洲云杉花粉活性、鱗皮云杉花粉活性、粗枝云杉花粉活性。

(4)TTC染色法可以代替離體培養法對云杉花粉進行活性測定。

4 討論

(1)從原理角度來看，TTC染色法適合于花粉呼吸作用較強的植物，通過花粉呼吸作用所產生的NADH2或NADPH2與TTC反應，變成紅色產物TTF。運用這種色差反應可判斷花粉活性。鐵軍等[11]運用TTC染色法對蘆薈屬植物進行花粉活性測定試驗，試驗效果較好。I2-KI染色法是根據其遇淀粉變藍的反應原理來論證花粉的活性，此方法不適用于云杉花粉，說明云杉花粉中含淀粉較少，不能與I2-KI溶液進行反應。醋酸洋紅法是對花粉體內積累的物質進行吸附作用從而染色，而云杉花粉極難染色，說明吸附作用太弱導致染色效果不佳。董曉莉等[9]在研究連翹花粉活力時發現醋酸洋紅法適合連翹花粉活力測定試驗。該試驗還發現在云杉花粉活性測定試驗中TTC染色法與離體培養法相關性極強，因此TTC染色法可以代替離體培養法對云杉花粉進行活性測定。

(2)利用SPSS對離體培養法中花粉萌發率進行方差分析，結果顯示硼酸和蔗糖的濃度對云杉花粉萌發具有顯著的影響。這一結論與馬健偉等[17]的研究結果大致相似。不同云杉花粉對培養基中最適蔗糖濃度不同，蔗糖作為碳源是花粉萌發及花粉管臂合成所必不可少的主要營養物質來源，多數云杉樹種以15 g/ml的蔗糖濃度試驗效果最好，這與葛莉莉等[18]的研究結果基本相同。但青海云杉以10 g/ml的蔗糖濃度試驗效果最佳，說明青海云杉花粉對于糖的吸收與其他5種云杉樹種相比可能較低。

[1] 王豁然,江澤平,傅紫菱,等.林木引種馴化與森林可持續經營[M].北京:中國環境科學出版社,1998：1-292.

[2] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志 第七卷[M].北京:科學出版社,1978：1-542.

[3] 李青粉,王軍輝,張建華，等.云杉引種及種和種源早期評價[J].林業科學研究,2012,25(5):644-650.

[4] 葛莉莉,樊文穎.青杄花粉保存方法試驗研究[J].內蒙古林業科技,2008,34(4):25-28.

[5] 童成仁,劉平生.呼和浩特樹木園云杉屬(Picea)引種及評估[J].內蒙古林業科技,2009,35(2):37-43.

[6] 何家慶.中國外來植物[M].上海:上海科學技術出版社,2012:229-230.

[7] 祁生秀,蔡晉翔，徐守成，等.國外云杉引種試驗[J].青海農林科技,2008(1):28.

[8] 賈子瑞,張守攻,王軍輝.7種云杉屬樹種花粉形態特征及其系統學的意義[J].電子顯微學報,2011,30(3):257-264.

[9] 董曉莉,關青,郝建平，等.不同花型連翹花粉活性比較[J].安徽農業科學,2013,41(22):9225-9227,9234.

[10] 劉絢霞.醋酸洋紅染色法測定油菜花粉的生活力[J].陜西農業科學,1998(1):23-24.

[11] 鐵軍,金山,吳志萍，等.兩種蘆薈屬(AloeL.)植物花粉活性和柱頭可授性的測定[J].晉東南師范專科學校學報,2004,21(2):7-9.

[12] 王連奎,孫延林.青杄云杉花粉生命力的測定與分析[J].吉林林業科技,2013,42(6):1-3.

[13] 劉林德,張萍,張麗，等.錦帶花的花粉活力、柱頭可授性及傳粉者的觀察[J].西北植物學報,2004,24(8):1431-1434.

[14] 王永勝,于殿華,王進洲.不同方法貯存的蜂花粉活性測定試驗報告[J].養蜂科技,1999(2):2-3.

[15] 曹孜義,劉國民.實用植物組織培養技術教程[M].蘭州:甘肅科技出版社,2003.

[16] 吳月亮,王明輝,劉明園，等.山杏花粉生活力及其貯藏力的研究[J].沈陽農業大學學報,2013,44(4):479-482.

[17] 馬建偉,王軍輝,張守攻，等.云杉花粉的貯藏及萌發研究[J].林業科學研究,2012,25(3):302-307.

[18] 葛莉莉,趙文義,阿騰戈，等.云杉花粉生活力及貯藏方法試驗研究[J].內蒙古林業科技,2007,33(4):33-34.

The Assay about the Activity of Six Kinds ofPiceaPollen

LIU Yu-ting1, LAN Deng-ming1*,YU Wei-li2et al

(1. College of Ecology and Environmental Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010019; 2. Inner Mongolia Academy of Forestry, Hohhot, Inner Mongolia 010019)

With introduced 30-40 yearsPiceaas research object, through determination of pollen activity, the adaptability of introducedPiceato environment was analyzed and discussed, which will provide theoretical basis for carrying out hybrid breeding work. Four pollen activity determination methods were adopted to conduct experiments on six kinds ofPiceapollen. The results showed tha among four kinds of methods, I2-KI staining and acetocarmine staining are poor test results, TTC staining andinvitroculture test are better. By TTC staining and in vitro culture method for measuring the activity of pollen, pollen activity showedP.meyeriis the highest, the lowest activity isP.asperata. And differentPiceapollen optimum concentration of sucrose are different, most are 15 g/ml of the sucrose concentration test the best, however,P.crassifoliais 10 g/ml sucrose concentration test the best results. Six kinds ofPiceapollen optimum concentration of boric acid in the culture medium was 0.05 g/ml.

Piceapollen; Activity; Assay method

內蒙古林業廳科技支撐項目(內林科研[2013]2號)。

劉禹廷(1990-)，女，內蒙古烏海人，碩士研究生，研究方向：植物多樣性保護與利用。*通訊作者，教授，從事野生植物資源保護與利用研究。

2015-04-20

S 791.18

A

0517-6611(2015)17-241-05