代謝工程中途徑和菌株改造的幾種新技術

孫新曉，唐秋雅，袁其朋

（北京化工大學化工資源有效利用國家重點實驗室，北京 100029）

引言

從 1991年首次提出代謝工程的概念，已經有20多年的發展歷史。代謝工程通過對菌株進行遺傳改造，重新配置細胞的生化代謝網絡，將可再生原料轉化成有附加值的化合物。然而，通過操縱內源基因和引進外源途徑，改造微生物長期進化的代謝網絡，經常會導致途徑通量的顯著不平衡，進一步產生多種不良后果[1]。例如，中間代謝產物的積累可能對上游酶產生反饋抑制，導致副產物的形成，降低了產品的生產效率[2]。因此解決代謝失衡問題，可以大大改善細胞的生長狀況、產品產量及產率。其中，找到最佳途徑平衡點是菌株改造過程的重要一步。

代謝工程的早期研究通過解除酶的反饋抑制、簡單的基因敲除或過表達等理性方法解決途徑中存在的瓶頸。例如，Liao課題組[3]通過對途徑中的酶進行篩選，并采用汽提的方式不斷分離發酵液中產物，最終發酵罐中異丙醇的產量可達143 g·L-1。然而，僅僅對菌株進行局部改造經常會引入新的、意想不到的瓶頸。由于代謝網絡各支路及基因之間的相互關聯性，導致需要從全局水平進行代謝調控。DNA測序技術、組學技術以及基因組水平的計算機模擬技術的進步，使得全局水平的菌株及途徑優化成為可能。例如，Becker等[4]通過計算機模擬對代謝網絡進行分析，對參與中心代謝的12個基因靶點進行調節，將代謝流導向產物的合成，最終谷氨酸棒桿菌中賴氨酸產量達到了120 g·L-1。除了以上的分析及調控技術，最近幾年又出現了一些新的代謝途徑的調控技術，比較有代表性的包括多變量的模塊化優化技術、蛋白質支架技術、代謝流量的動態調控技術以及大規模基因編輯技術。

1 多變量的模塊化優化技術

多變量的模塊化優化技術將代謝途徑中的酶按照途徑節點、酶的催化效率等分成幾個模塊，通過在轉錄（如啟動子，基因拷貝數）、翻譯（如核糖體結合位點）或酶的催化特性等水平對這些途徑模塊進行調整，對少量條件進行摸索，不需要高通量篩選就可實現途徑的優化。Ajikumar等[5]利用該技術成功提高了紫杉醇前體紫杉烯的產量。他們將紫杉烯合成途經分成上游2 -甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)模塊和下游模塊。然后通過改變啟動子強度和質粒拷貝數調節酶的表達水平，限制副產物吲哚的積累。最終紫杉烯產量與對照菌株相比提高了15000倍，達到1 g·L-1。

認識到該方法的應用潛力后，許多課題組也運用這一方法，進行各種生物過程的開發和優化。Koffas等[6]利用模塊化優化改造大腸桿菌，將大腸桿菌的中心代謝途徑分成3個模塊：乙酰輔酶A的合成(GLY模塊)，乙酰輔酶A活化(ACA模塊)，丙二酰ACP消耗(FAS模塊)。通過改變質粒拷貝數和核糖體結合位點的強度，能夠平衡這3個模塊，為后續的下游反應提供適量的乙酰輔酶A，最終脂肪酸產量達到8.6 g·L-1(圖1)。Liu等[7]將N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)合成途徑分為外源GlcNAc的合成模塊、GlcNAc糖酵解模塊和肽聚糖合成模塊。通過同時改變內源和外源基因的表達，優化菌株可以產生36.35 g·L-1的GlcNAc，比對照菌株提高3.8倍。本課題組[8]也利用該技術優化了大腸桿菌的黏糠酸合成途徑，最終黏糠酸產量提高了275倍，達到 1.5 g·L-1。

圖1 模塊化優化大腸桿菌脂肪酸生產[6]Fig.1 Modular optimization for fatty acids production in E. coli[6]

Wu等[9]將白藜蘆醇的合成途徑分成3個模塊，分別為香豆酰輔酶A合成模塊、丙二酸輔酶A合成模塊以及二苯基乙烯(stilbene)合成酶模塊。通過調整3個模塊的表達水平，平衡了途徑的通量，避免香豆酰輔酶A的毒性積累，直接從葡萄糖產生35.03 mg·L-1的白藜蘆醇。類似地，他們還建立了四模塊系統用于從葡萄糖生產(2S)-松屬素。通過簡單地改變每一個模塊質粒的拷貝數，減少了肉桂酰輔酶A的毒性積累，產生了40.02 mg·L-1的(2S)-松屬素[10]。Zhao等[11]進一步將該技術擴展到五模塊系統，用于β-胡蘿卜素的生產。其途徑包括MEP和下游合成酶模塊，以及 ATP的合成、TCA循環和磷酸戊糖生產3個模塊。通過調換啟動子和mRNA穩定區域來調節表達，提供了更多的前體進入外源β-胡蘿卜素的途徑，最終產量達到2.1 g·L-1。

除了在原核系統優化中的成功應用，多變量的模塊化優化技術也成功應用于真核系統。Dai等[12]將次丹參酮二烯(miltiradiene)合成的上游前體供應途徑分為兩個模塊：法尼基焦磷酸的合成和異戊二烯焦磷酸合成。通過在含有染色體整合的次丹參酮二烯合成酶的菌株中用不同的質粒表達每個模塊，成功地增加了前體供應，將次丹參酮二烯產量提高到 488 mg·L-1。

以上這些例子說明，模塊的結構、目標化合物的種類以及宿主的范圍呈現出多樣性，顯示了該方法廣泛的適用性。總的來說，該技術為代謝工程提供了一個通用的、簡單有效的半組合菌株優化工具。

2 酶的支架技術

代謝途徑的中間產物可能對宿主產生毒性，被競爭途徑消耗，或通過分泌丟失。解決這些問題的一個新興的策略是將合成途徑的酶組合成多酶復合物。該策略將途經中的酶共定位形成最優比例的復合物，可以增加途徑代謝產物和酶的局部濃度，限制途徑中間體的積累，減少與其他細胞成分之間不必要反應的發生。多酶復合物在自然界中是常見的。例如，催化色氨酸合成的最后兩個步驟的酶可以形成復合物，中間產物吲哚通過一個通道由一個活性位點到達另一個[13]。聚酮和脂肪酸合成相關酶是多酶復合物形成的另外的例子[14]，中間體在酶之間穿梭最終形成特定長度和化學結構的終產物。

將酶組合成復合物的第一種方法是將催化連續反應的酶進行融合。酶-酶融合策略在某些情況下能夠增強途徑通量，然而，該策略有3個明顯的缺點：①不適用于包含超過兩個酶的途徑；②融合之后經常會導致一個或者兩個酶活性的降低；③不能輕易地改變復合物中酶的比例。酶的合成支架技術為途徑中兩個或多個酶的共定位提供了新的方法。蛋白質、DNA和RNA都可以作為支架用于酶復合物的形成。

許多信號蛋白包含模塊化的蛋白質相互作用域，可以特異性地與其他域或短肽結合。當這些域融合到其他蛋白的N端或者C端時，還可以保持結合功能。攜帶多個蛋白質相互作用域的支架蛋白可以和帶有多肽配體標簽的酶相互作用，用于共定位途徑中連續的酶。通過改變蛋白支架上結構域的數量，可以控制不同酶的相對比例。因為只需要在每個酶上加一條短肽，因此蛋白質支架技術對酶活性的影響要低很多。甲羥戊酸的生物合成途徑包括乙酰乙酰輔酶 A轉移酶(AtoB)、羥甲戊二酰輔酶 A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)和 HMG-CoA 還原酶(HMGR)。利用該途徑，由乙酰輔酶A生產甲羥戊酸，存在 HMGS和HMGR之間流量不平衡的問題，導致中間產物HMG-CoA的積累。HMG-CoA對宿主大腸桿菌細胞具有很強的毒性。通過蛋白質支架將 HMG-CoA產生和消耗酶之間的共定位(HMGS和 HMGR)，調節兩個酶的比例，使甲羥戊酸的產量提高了10倍。通過另外一個支架分子將途經的第一個酶(AtoB)引入到復合物中，使甲羥戊酸的產量較無蛋白支架的對照提高了77倍[15](圖2)。相同的策略被應用于含有3個酶的葡糖二酸合成途徑。在該途徑中，肌醇氧化酶(MIOX)可以被其底物肌醇激活。通過蛋白支架，增加了MIOX周圍肌醇的濃度，進而使葡糖二酸產量提高5倍[16]。

圖2 運用蛋白質支架技術優化甲羥戊酸生物合成[15]Fig. 2 Optimization of mevalonate production using protein scaffold technology[15]

類似地，研究者對 DNA分子作為支架用于酶的聚合進行了研究。DNA之間可以通過雜交進行結合，DNA和蛋白質之間可以通過鋅指DNA結合域實現相互作用。在一項研究中，葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶通過賴氨酸殘基與 DNA寡核苷酸共價交聯，特異性地與多聚六面體 DNA納米結構雜交。當酶的間距由從4個六面體 (約33 nm)縮短到2個六面體(約13 nm)，產物的產量有了顯著的增加，表明途徑酶彼此靠近確實有利于提高產物的形成[17]。然而，將寡核苷酸共價結合到酶上以及組裝DNA納米結構，操作煩瑣，使該策略難以實際應用。Delebecque等[18]構建了序列對稱的RNA結構模塊，允許聚合成一維或兩維RNA支架。每個RNA結構模塊中包含PP7和MS2適配體域(aptamer domain)，用于結合PP7和MS2融合蛋白。熒光互補實驗表明，二維RNA支架在細胞中形成穩定的約100 nm的球形結構，使融合蛋白能夠近距離聚集。利用RNA支架進行氫酶和鐵氧還蛋白(ferrodoxin)的共定位，使氫氣產量提高了約48倍。

3 代謝流量的動態調控技術

在菌株的代謝工程改造過程中，大多數提高產量(yield)的策略往往會減慢菌株的生長速率，進而會導致低容積生產率(productivity)，增加工業設備投資費用。在接近最佳理論產量的菌株中，大部分代謝流量被導向產物合成，因此單獨優化代謝網絡不足以顯著提高生長速度。兩階段培養策略將發酵過程分為前期生長階段和后期產物生成階段。該方法可以顯著改善細胞生長，增加最終產物產量。例如，將乳酸生產過程分成需氧生長階段和厭氧生產階段。與單級厭氧策略相比，兩階段策略的生產率可以提高約10倍，達到3.32 g·L-1·h-1[19]。該策略還用于 1,4-丁二醇生產，細胞需氧生長至 OD600達到10，然后切換到微好氧條件并使用IPTG誘導途徑基因表達，1,4-丁二醇產量可達18 g·L-1[20]。兩階段發酵已經證明可以成功用于厭氧產品和高價值蛋白的生產；然而，有些產品的途徑難以與過程水平參數耦合，可能導致無法使用氧濃度或pH作為觸發來切換培養狀態，而且使用誘導劑，如IPTG，成本過高。為了解決這些問題，研究者提出了動態控制策略，以允許兩階段發酵和基因表達的動態控制。動態代謝調控主要依靠合成生物學的進展，創造遺傳傳感器(sensor)和執行器(actuator)。Williams等[21]利用信息素和 RNA干擾技術建立了一個群體感應系統，用于在釀酒酵母中生產對羥基苯甲酸(PHBA)。在發酵初期，通過抑制生產途徑基因，表達分支酸變位酶(ARO7)基因，實現菌株正常生長。當達到合適的細胞密度，使用RNA干擾抑制ARO7基因的表達，同時開啟生產途徑基因的表達，最終PHBA的產量達到1.1 mmol·L-1，是目前報道的釀酒酵母中的最高產量。開關基因控制也可以用溫度或誘導劑作為觸發器來實現。利用噬菌體Pr和PL啟動子控制乳酸脫氫酶基因(ldhA)，使得在 33℃生長時ldhA表達受到抑制，與靜態策略相比生物量增加了10%。切換到42℃誘導ldhA基因的表達，最終的乳酸產量提高了30%[22]。類似的開關被設計用于生產異丙醇。生長階段是通過表達檸檬酸合成酶(gltA)，抑制通路基因實現高增長率。通過添加IPTG，抑制gltA表達和誘導途徑基因表達使流量導向異丙醇生產[23]。

上面的例子都是簡單的開-關控制策略，在整個發酵過程只開關一次。連續控制能夠動態地感測環境和代謝流的變化，并使細胞對這些變化作出反應。Farmer等[24]利用受乙酰磷酸激活的傳感器感應過量的糖酵解流量，動態地控制番茄紅素合成基因的表達，提高了番茄紅素的產量和生產率。最近，通過動態控制，在檢測到毒性代謝物時上調外排泵相關基因的表達，利用合成反饋回路提高產量。Xu等[25]將動態調控策略運用到大腸桿菌脂肪酸的生產中。來自枯草芽孢桿菌的 FapR蛋白能夠感知脂肪酸合成前體丙二酸輔酶A的濃度，激活pGAP啟動子的轉錄，抑制 T7啟動子的轉錄。含有代謝開關的工程菌株能夠動態地調節上下游基因的表達，使代謝流量有效地導向脂肪酸的合成。通過動態調控，平衡細胞生長和產物合成，與野生菌株相比脂肪酸產量提高了15.7倍(圖3)。

通過轉錄組分析可以尋找和鑒定動態感應器，識別對途徑中間體敏感的啟動子并利用它們來控制生物合成路徑。雖然動態調控策略已有許多成功應用的例子，但是為目標產物尋找合適傳感器和執行器可能費時費力。

4 大規模基因編輯技術

在基因組范圍內高度特異性的消除、替換或修飾序列的能力具有重要的基礎和實際應用，包括關鍵基因的發現，植物和微生物生物工程和基因治療等。體內靶基因的編輯可以通過人工蛋白核酸酶異位表達來實現，例如，鋅指核酸酶(ZFN)或轉錄活化劑樣的效應核酸酶(TALENS)，用于識別特定的目標 DNA位點和引入雙鏈 DNA斷裂[26-27]。不同的DNA修復途徑可以產生不同類型的突變。在有同源模板存在的條件下，可以通過高保真的同源重組途徑進行基因替換、刪除或校正。如果不存在同源模板，細胞通常通過相對易錯的非同源末端連接來修復雙鏈DNA斷裂。這通常會導致基因插入或缺失，因此，可以產生基因的失活突變。

圖3 利用動態調控技術優化大腸桿菌脂肪酸合成[25]Fig. 3 Optimization of fatty acid production inE. coliusing dynamic pathway regulation[25]

CRISPR-Cas9系統是最近出現的、可調節的下一代基因組編輯工具[28]。最近幾年大量的研究已經成功應用該系統在不同類型的細胞和模式生物中進行RNA指導的基因組編輯。CRISPR-Cas9系統包含單一蛋白質Cas9，是一種RNA指導的核酸內切酶，其催化平末端雙鏈 DNA斷裂。該系統需要兩種 CRISPR RNA(crRNA)：一種通過堿基配對引導Cas9到達 DNA靶序列；另一種反式激活crRNA(tracrRNA)，與crRNA配對，在靶DNA裂解過程中具有尚不明確但很重要的作用。這兩種RNA可以通過 RNA環連接形成單個指導RNA(sgRNA)，使系統簡化成只有一個蛋白質(Cas9)和一個RNA(sgRNA)[29]（圖4）。該系統要求目標位點下游具有一段很短的 PAM 序列。最廣泛使用的Cas9酶來自化膿性鏈球菌。它所需的PAM序列為5′-GG-3′(或 5′-AG-3′，活性略低)并且位于靶位點下游1個堿基處。

Cas9蛋白需要經過密碼子優化以促進其在異源細胞或生物體中的表達，而且在真核物種中還需使用核定位信號。與ZFN或TALENS相比，RNA指導的 Cas9基因組編輯在多個系統具有相近的或者更高的效率。此外，基于Cas9的基因組編輯相比蛋白介導的 ZFN和 TALEN系統具有若干優點：Cas9靶向新的DNA位點只需設計與靶DNA互補的sgRNA，使該方法更快捷、更便宜，并且更容易實現，相比之下需要為每個目標位點開發新的ZNF和TALEN蛋白；通過表達多個sgRNA，Cas9平臺允許對多個位點同時進行編輯。Jiang等[30]利用RNA指導的 Cas9基因組編輯技術能夠在Streptococcus pneumoniae和大腸桿菌引入特定突變，成功率分別為 100%和 65%。通過引入兩條crRNAs還可實現多位點同時突變。Keasling課題組[31]利用該技術同時對5個基因位點進行修飾。不需要過表達任何基因，僅通過組合基因敲除，使甲羥戊酸的產量提高了41倍。這些例子充分證明了該技術在原核及真核生物里的普遍適用性及高度位點特異性。

圖4 CRISPR-Cas9系統原理示意圖[29]Fig. 4 Schematic diagram of CRISPR-Cas9 system[29]

Cas9采用不同的活性位點（RuvC和HNH核酸酶結構域）切割靶 DNA的兩條鏈。通過突變可以使一個位點失去活性，產生只切割一條鏈的突變Cas9。因此，野生型Cas9可用于雙鏈DNA裂解，而活性位點突變體(RuvC或 HNH)僅切割單鏈。這將為向基因組中引入可預測的突變提供可靠的方法。如果Cas9的兩個核酸酶結構域同時失活，則產生了僅具有 DNA結合功能的突變蛋白。利用這種核酸酶缺陷的 Cas9靶向啟動子元件會導致基因轉錄的明顯下降。這種新穎的平臺被稱為CRISPR干擾(CRISPRi)[32]。核酸酶缺陷Cas9也能與轉錄抑制子結合位點作用激活基因的表達。Cas9復合物還可以通過與特異性轉錄激活因子或抑制因子融合，用于激活或沉默基因的表達[33-34]。這些CRISPR轉錄因子可與sgRNAs一起識別特定的轉錄控制元件，對目標位點內源基因的表達產生可預測的影響。

5 結 論

本文總結介紹了4種代謝工程的新技術，可以從不同層次水平對菌株和途經進行調節和優化。基因元件的模塊化、標準化不僅可以有效地簡化途經優化的工作量，而且通過相關模塊的簡單組合可以組建新的合成途徑。目前標準生物部件登記處(Standard Biological Parts registry)數據庫已經收集了超過5000個標準化的部件。該數據庫的進一步豐富和發展將會極大地推動人工代謝途徑的設計和構建。酶的支架技術從翻譯后水平調節酶之間的空間組織順序和比例，以較低的表達量實現較高的催化效率，還可以減少與細胞其他成分不必要的相互作用。代謝流量的動態調控技術通過感應及效應元件，根據細胞的不同生長階段及代謝物水平，調節基因的轉錄表達，平衡細胞的生長和產物合成，可以有效地提高產量和產率。為了進一步提高其有效性和適用性，還需要尋找具有更高魯棒性(robustness)和快速反應性的調控元件。CRISPR-Cas9是一種強大的基因組編輯和基因表達調控工具。然而，對該系統的認識還很不完整，該技術的其他工具和應用還會不斷出現。總之，這些新技術的進一步發展必將為代謝工程增添新的活力，降低發酵成本，提高產品的多樣性，為各種化合物的綠色生產奠定基礎。

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