高分子大孔微球的制備和結構控制

周煒清，李娟，那向明，馬光輝

（中國科學院過程工程研究所國家生化工程重點實驗室，北京 100190）

引言

高分子多孔微球是一種具有高附加價值的化工產品，在很多領域都具有重要的應用，例如作為吸附分離填料、催化劑載體、藥物緩控釋制劑等。根據孔徑大小的區別，多孔微球通常分為微孔（<2 nm）、介孔（2～30 nm）、大孔（30～100 nm）和超大孔（>100 nm），微球的結構控制是在不同領域獲得成功應用的保障。例如，藥物分離純化的填料，孔徑越小往往比表面積越高、載量越大，但小孔徑會造成相對分子質量較大的生物分子難以進入孔道，或者進入孔道后受到剪切力的影響，致使活性降低。微球應用于藥物緩釋制劑時，結構決定了緩釋行為、與體內細胞相互作用等，因此需要針對不同的應用設計結構合理的微球。本文主要介紹作者所在的研究團隊在大孔和超大孔微球的制備、結構調控以及應用等方面的研究進展。

孔徑大于100 nm的超大孔微球在超大生物分子（疫苗、抗體等）的分離純化、固定化酶等方面具有獨特的特點。以作為乙肝疫苗分離純化介質為例，超大孔微球展現了流速快、分離效率高的特點，同時更為關鍵的是，乙肝疫苗的活性收率比常規介質大幅提高（分別為 40%和 10%）。與大孔微球的制備技術相比，由于利用有機溶劑與聚合物之間的相分離一般只能獲得數十納米的微球，必須發展新的過程來制備超大孔微球。分別發展了反膠團溶脹法和 W/O/W 復乳法，得到以不同材料為基質的、孔徑在百納米級以上可控的超大孔微球。

1 新型超大孔微球的制備和結構調控

制備大孔微球的常規方法是利用有機溶劑制孔劑和聚合物之間的相分離制備出孔道，但是這種方法很難得到百納米級以上的微球，因此，發展了新的制備過程來制備超大孔微球，利用水和疏水性聚合物之間相分離程度遠大于有機溶劑與聚合物間的相分離程度的特點，獲得超大孔微球。這一過程中，如何將水作為制孔劑導入液滴內是一個難點。發展了兩種方法，一種是反膠團溶脹法，一種是復乳液法。

1.1 反膠團溶脹法制備疏水性超大孔微球

如圖1所示，將足夠量的油溶性表面活性劑溶解在苯乙烯（styrene，ST）中，然后將 ST分散在水相中，形成O/W型乳液，表面活性劑在油相中形成反膠團，反膠團能夠從水相中吸入大量的水而形成水的微通道，升溫聚合后聚合物相和水相繼續發生相分離，最終形成較大的微水相通道，除去水相即可得到超大孔微球[1-3]。從上述成孔機理可知，影響反膠團吸水溶脹過程以及水-聚合物相分離的因素也會對最終得到的孔道結構造成影響。主要的影響因素包括：表面活性劑的添加量、表面活性劑的類型和稀釋劑。

表面活性劑的添加量對孔徑的尺寸有重要影響，當采用Span 80為表面活性劑，含量為30%（以ST和DVB的總質量為基準）時，孔徑較小，僅為50 nm。當Span 80含量增至40%時，PST微球的孔徑可達到500 nm（圖2）。同時，孔容由1.62 mL·g-1增加至2.65 mL·g-1，孔隙率由65.5%增加至83.6%。孔徑和孔隙率的迅速增加只靠表面活性劑量的增加是達不到的，凸顯了反膠團從外水相中吸收水的重要作用[1]。

另一個影響反膠團吸水溶脹過程的主要因素是表面活性劑的親水親油平衡值（HLB值）[3]。使用電導測定的方法，考察了不同表面活性劑對反膠團吸水溶脹形成的乳液結構的影響。對于選擇的四種表面活性劑Span 85（HLB 1.8）、Span 80（HLB 4.3）、PO-500（HLB 4.9）以及Span 80-Tween 80復合表面活性劑（HLB 9.65），含有Span 85的體系，由于其疏水性較強，Span 85在油相中的溶解性更好，它的反膠團也相對比較穩定，不容易聚集到一起，這就造成碰撞概率較低、通道的尺寸較小（圖3）。聚合結果[圖4（a）]，也反映了這一點。含Span 80-Tween 80復合表面活性劑的體系，其電導率行為與其他體系有很大不同，它的電導率增長十分迅速。這是由于復合表面活性劑的親水性強（Span 80和Tween 80的質量比為1∶1，HLB值為9.65），吸入水后，表面活性劑反膠團更容易聚集在一起，這使電導率迅速上升。從該體系聚合物微球的 SEM 圖可以看出[圖4（d）]，球內形成了一個大的空腔，這也揭示了電導率如此之高的原因。

圖1 反膠團溶脹過程制備超大孔微球的機理示意圖Fig.1 Illustration of formation mechanism of gigaporous microsphere by reverse-micelle swelling process

圖2 孔徑為500 nm的超大孔聚苯乙烯微球的電鏡照片（a）和不同Span 80含量制備的微球的孔徑分布曲線對比（b）Fig.2 SEM image of gigaporous PST microspheres (pore size 500 nm) (a) and pore size distribution curves of microspheres prepared by different Span 80 content

1.2 膠團溶脹法制備親水性超大孔微球

圖3 不同表面活性劑對乳液電導率的影響Fig.3 Effects of different surfactants on conductivity of W/S/O emulsion (surfactant concentration 40%)

圖4 不同表面活性劑制備的微球Fig.4 Polymer particles prepared with different surfactants(Preparation condition：ST 3.0 g; crosslinking degree：13.8%; amount of surfactant 40%)

在上述實驗基礎上，進一步考察了親水性超大孔微球如瓊脂糖微球的制備。親水體系超大孔微球的制備過程與疏水體系相似，但是需要將水溶性表面活性劑加入水相中，形成膠團，再將水相分散于油相，膠團的疏水內核會把外油相吸入水相中進而溶脹，水相液滴固化后形成超大孔微球。同樣，影響微球結構主要因素包括表面活性劑的類型與用量，與疏水體系的差別之一，在于還需要考慮動力學因素的影響。由于親水體系水相（瓊脂糖溶液、葡甘聚糖溶液等）的黏度遠遠大于苯乙烯等單體體系，吸油過程中，油相向水相內的擴散緩慢，必須給予足夠的溶脹時間，才能夠形成大孔結構（圖5）。

圖5 吸油溶脹時間對瓊脂糖微球表面形貌的影響Fig.5 Effect of oil-absorbing duration on morphology of agarose microspheres

此外，以親水高分子為出發原料制備超大孔微球時，微球結構同樣會受到熱力學和動力學因素的影響。由于向水相中添加了大量表面活性劑，水相性質發生變化，以瓊脂糖體系為例，水相黏度和油水界面張力下降，瓊脂糖的凝膠化溫度也因此改變。而凝膠化溫度附近的溫度變化對孔道形成的影響很大，因此測定了加入表面活性劑后的瓊脂糖溶液的凝膠化穩定。通過測定凝膠體系的彈性模量G′和黏性模量G″隨溫度變化的曲線，得到二者交點對應的溫度即為體系由溶液狀態向凝膠狀態轉變的臨界溫度，即為體系的凝膠化溫度，如圖6所示。

圖6 預引入表面活性劑后瓊脂糖體系凝膠化溫度的確定Fig.6 Determination of gelating temperature of agarose system containing surfactant

結果表明，當水相中引入表面活性劑后，凝膠化在43℃時發生，這比未加表面活性劑的瓊脂糖溶液（36℃）有所上升。即當含有表面活性劑的瓊脂糖溶液溫度降低至43℃左右開始凝膠化，繼續降溫至40℃以下，固化基本結束，此時體系由流動性良好的溶液轉變為不可流動的凝膠。于是，重點考察了30～50℃溫度范圍內，固化速率對瓊脂糖微球孔道結構的影響。在其他制備條件不變的情況下，分別以0.1、0.5、10℃/min進行固化，所得瓊脂糖微球的電鏡照片如圖7所示。

從圖中可以看出，固化速率越慢，所得瓊脂糖微球孔徑越大。當固化速率降低至 0.1℃/min時，微球表面大孔清晰可見，甚至可以觀察到微米級的超大孔結構。隨著固化速率的加快，凝膠孔徑呈下降趨勢。如果以10℃/min的速度迅速固化，瓊脂糖纖維束內形成的氫鍵數量有限，纖維束結構較疏松，束間容易發生聚集，導致孔徑明顯減小。

1.3 復乳法制備超大孔微球及其結構調控

將水相導入油滴內的另一個方法為復乳法，將內水相分散在聚合物溶液中制備成W1/O初乳，然后將初乳繼續分散在外水相中制備成 W1/O/W2復乳，最終除去溶解聚合物的有機溶劑，并調控溶劑去除過程，使內水相在溶劑去除過程中相互融合形成貫穿孔，最終獲得超大孔微球[4]。

圖7 不同固化速率下瓊脂糖微球的電鏡照片Fig.7 SEM images of porous agarose microspheres obtained with different solidification rate

復乳液是典型的熱力學不穩定體系，一般存在油滴間相互融合、內腔間融合、內水相逃逸、內腔收縮4種演變過程。對于近乎所有的多腔復乳液滴，這4種演變是同時存在的，不同階段會表現出不同的主導方向。其中，界面穩定性和分子擴散是影響復乳演變的關鍵因素。復乳液固化也是一個動態過程。當固化速率明顯快于復乳演變過程時，微球、微囊會保留乳液模板的形態特征，如各種微囊結構；當固化過程伴隨著形態演變時，將會形成超大孔微球。通過復乳液演變與復乳液固化對超大孔微球進行結構調控，如圖8所示。

圖8 復乳液演變與復乳液固化對超大孔微球結構的調控Fig.8 Morphology evolutions of W1/O/W2double emulsion and solid microcapsules illustrated by cartoon chart

以聚乳酸-聚乙二醇（PELA）為出發原料為例，如圖9所示，分別對界面穩定性和分子擴散進行了控制。界面穩定性方面，在外水相中添加聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA），而在內水相中未添加任何表面活性劑，其目的在于創造較為穩定的O/W2界面和相對不穩定的W1/O界面，從而使得演變只發生在油滴內部，減少了內水相向外逃逸。在分子擴散方面，使復乳先熟化6 h，等內水相之間發生一定融合后再固化，固化過程中內水相和外水相也發生一定的融合，便可獲得具有貫穿孔的超大孔微球。如果使復乳熟化更長的時間再固化，內水相之間會發生更多的融合，甚至融合為單一腔室，無法獲得理想的超大孔微球。

2 微球結構對應用效果的影響

2.1 微球介質的孔徑對分離效果的影響

多聚亞基蛋白質、抗體、PEG-蛋白質偶聯物等超大生物分子藥物的發展非常迅速，對分離純化提出了高的需求。這些超大生物分子的相對分子質量很大或者水力學半徑大，而現有一般介質孔徑小，超大生物分子進入介質速度慢，甚至進入不了介質內部，造成分離困難。對上述合成的PST超大孔微球進行進一步親水化處理并改性后，用于超大生物分子的分離[5-10]。以乙肝疫苗的分離純化為例[11]，孔徑為280 nm超大孔介質在高流速、高分離效率的同時，還展示了更高的載量、活性回收率和純化倍數（圖 10）。其原因在于超大孔結構能夠有效減少抗原的多位點吸附并降低了乙肝疫苗的亞基解聚。

2.2 微球孔徑對固定化酶的影響

圖9 不同復乳演變時間的液滴固化后的掃描電子顯微鏡照片Fig.9 SEM images of W1/O/W2emulsion templated microcapsules after different ripening time

圖10 用不同的DEAE弱陰離子交換介質分離純化乙肝表面抗原的結果比較（載量、回收率、純化倍數）Fig.10 Separation results (loading quantity, HBsAg recovery, purification fold) of HBsAg by using different microspheres as separation media

圖11 不同溫度下固定化酶的熱穩定性Fig.11 Effect of temperature on enzyme thermal stability at two different temperatures

圖12 固定化酶的重復利用性Fig.12 Reusability of immobilized enzyme in stimulant system of olive oil hydrolysis (a) and in real system ofp-NPP hydrolysis (b)

酶在載體上的固定化，根本上也是蛋白與界面的作用。在上述超大孔微球用于生物大分子取得良好效果的基礎上，進一步考察了作為酶固定化載體的效果，也取得很好的結果。在不同孔徑的聚苯乙烯（PST）微球上進行了脂肪酶（amano lipase PS,fromBurkholderia cepacia）的固定化，選用的PST微球分別為介孔微球（14 nm）、大孔微球（100 nm）和超大孔微球（300 nm）[12]。發現超大孔微球固定化酶的熱穩定性顯著增加，如圖11所示。在50℃條件下，無論何種固定化酶，其酶活在6 h后仍保持在80%以上。當溫度升高到70℃時，經過6 h的處理，不同孔徑載體上的固定化酶酶活出現顯著差異?？疾旃潭ɑ傅馁A存穩定性時，從酶的脫落情況來看，常溫儲存15 d后，超大孔微球固定化酶幾乎沒有蛋白脫落，而大孔和介孔微球的固定化酶分別有 5%和 15%的脫落。從酶活保持來看，在保存了15 d后，介孔微球固定化酶的酶活不足10%，而相同條件下的超大孔和大孔微球的固定化酶分別保留了 67.5%和 63.3%的活性。在重復使用性的對比中，超大孔微球固定化酶也顯示出顯著的優勢（圖12）。由于3種固定化酶載體都是聚苯乙烯基質，固定化酶結果的差異也證明了不同的孔道結構對酶分子結構的影響。

3 結 論

本文針對大孔和超大孔微球的制備和結構控制進行了系統的研究，并探討了微球的結構對其應用效果的影響，得出以下結論。

（1）利用反膠團溶脹法和復乳法，成功將水致孔劑導入液滴內，制備出了超大孔微球（孔徑>100 nm）。系統研究了孔道形成機理和各主要因素對于孔結構的影響規律，建立了不同基質超大孔微球的制備和結構調控方法。

（2）利用微球的結構可控性，研究了不同結構的微球作為蛋白質分離純化介質和固定化酶載體的應用效果。超大孔介質大幅度提高了超大生物分子乙肝疫苗的吸附載量、純化回收率和純化倍數。作為固定化酶載體能夠有效提高酶活、酶的穩定性和重復使用次數。

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