發酵粗甘油產乳酸的戊糖乳桿菌代謝進化

王世珍，嚴正平，邱隆輝，方柏山

（1廈門大學化學化工學院，福建 廈門 361005；2廈門市合成生物學重點實驗室，福建 廈門 361005）

引言

近年來隨著生物柴油的規模化發展，以其廉價副產物粗甘油為原料直接發酵生產乳酸對乳酸工業及生物柴油產業都具有十分重要的現實意義和經濟價值[1-2]。目前，微生物法將甘油轉化為乳酸的研究尚處于起步階段[3]，國內外利用甘油發酵生產乳酸的研究報道并不多，Mazumdar等[4]利用重組大腸桿菌，發酵40 g·L-1甘油得到32 g·L-1、光學純度達到99%的D-乳酸，乳酸產率達到1.5 g·L-1·h-1。洪安安等[5-6]篩選到一株大腸桿菌 AC-521，能代謝甘油發酵生產乳酸，該菌株在5 L發酵罐水平，補料分批發酵88 h后，乳酸產量可達85.8 g·L-1，同時會有副產物乙酸、丁二酸、乙醇和 1,3-丙二醇生成。田康明等[7-8]利用乳酸高產大腸桿菌 CICIM B0013-070，建立并優化了一種新型 D-乳酸變溫發酵工藝，并通過引入溫度誘導型乳酸脫氫酶的轉錄系統，發酵得到98.5 g·L-1的乳酸并使甘油到乳酸的得率達到88.9%。與葡萄糖等傳統發酵原料相比，以粗甘油作為發酵底物會導致菌體生長緩慢、菌濃較低，產酸速率和終產物濃度偏低等一系列問題[9]。

代謝進化（metabolic evolution）[10-11]是利用適應進化有效提高微生物發酵生產速率、產率和終濃度的技術。在微生物發酵過程中，底物利用過程一般產生能量（ATP）和還原力（NADH），而很多產物的合成過程則是消耗還原力。通過遺傳改造構建出初級的微生物細胞工廠，使目標產物成為消耗還原力的唯一代謝途徑，從而使能量產生和還原力平衡相偶聯。因此，通過在發酵反應器中連續傳代培養微生物，篩選生長速率大的突變菌，可以同步篩選出目標產物生產速率、產率和終濃度均顯著提高的突變菌[12-13]。Ingram 等[14]利用此技術，成功提高了大腸桿菌發酵生產乙醇、L-乳酸、D-乳酸等化合物的生產性能，效果非常顯著（提高1~2個數量級）。Zhang等結合途徑理性設計和代謝進化，成功構建了大腸桿菌代謝工程菌，使其能高效生產 L-丙氨酸[15]、丁二酸[16-17]。其中L-丙氨酸工程菌能使用簡單無機鹽培養基，在厭氧批式培養條件下，48 h內生產115 g·L-1的L-丙氨酸，產率達到95%，手性純度達到 99.5%，使生產成本大大低于目前使用的酶催化技術。丁二酸工程菌能利用簡單無機鹽培養基，在厭氧批式培養條件下，96 h內生產90 g·L-1左右的丁二酸，產率達到1.5 mol·mol-1葡萄糖。大腸桿菌[18]在代謝進化過程中激活了2條新型的能量保存途徑，使丁二酸發酵生產的同時能產生足夠的能量用于維持細胞生長代謝[19-20]。

本課題以廉價的工業粗甘油為底物，以自行篩選的戊糖乳桿菌為發酵菌株，通過微好氧發酵來生產乳酸，試圖建立一條低成本的乳酸生產路線。通過在發酵培養基中添加一定濃度的粗甘油或乳酸，對本實驗室早先篩選并保藏的野生戊糖乳桿菌R3-8[21](Lactobacillus pentosusR3-8)進行代謝進化，使菌株在含有這些物質的發酵培養基中不斷地進行傳代培養，并通過連續傳代培養使優勢菌不斷富集，以期馴化得到耐受高濃度底物和產物且具有高生產強度和產物終濃度的突變菌株。

1 實驗材料和方法

1.1 菌株

實驗室篩選的新型野生戊糖乳桿菌 R3-8（Lactobacillus pentosusR3-8），兼性厭氧，保藏于4℃ MRS培養基中。

1.2 主要試劑

酵母粉、胰蛋白胨購自OXOID。牛肉膏購自生工生物工程（上海）有限公司。葡萄糖、無水乙酸鈉、四水硫酸錳、三水磷酸氫二鉀、乳酸購自國藥集團化學試劑有限公司。吐溫80購自生工生物工程（上海）有限公司。氨水購自廣東化學試劑工程技術研究開發中心。檸檬酸氫二銨購自中國醫藥集團上海化學試劑公司。七水硫酸鎂購自廣東汕頭西隴化工有限公司。以上試劑均為分析純。色譜純甘油購自 Sigma。粗甘油由中國生物柴油國際控股有限公司下屬的廈門卓越生物質能源發展公司提供，其甘油含量約為97%。其他試劑均為國產分析純試劑。粉狀活性炭購自廣東光華科技有限公司，直接作為吸附劑使用。

1.3 主要儀器設備

主要儀器設備型號與廠商如下：pH計（PB-10，Sartorius）、Bioscreen C全自動生長曲線分析儀（FP-1100-C，Oy Growth Curves Ab Ltd）、電子天平（AR1530，奧豪斯）、恒溫搖床（SPH-200B，上海世平實驗設備有限公司）、冷凍離心機（5418 R，Eppendorf）、立式電熱滅菌鍋（HVE-50，Hirayama）、5 L全自動發酵罐（Biostat A Plus，Sartorius）、紫外-可見光分光光度計（UV-6100，上海美譜達儀器有限公司）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備有限公司）、高效液相色譜（1200，Agilent）、醫用冷藏柜 (4℃)（YC-260L，中科美菱）、醫用冷藏柜（-20℃）（DW-YW358A，中科美菱）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DH-9070AS，寧波江南儀器廠）、智能型生化培養箱（SPX，寧波江南儀器廠）。

1.4 培養基

MRS培養基（L-1）：葡萄糖20 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉膏10 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀 2 g，檸檬酸氫二銨 2 g，吐溫 80 1 ml，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g。pH 6.5，115℃滅菌30 min。種子培養基（g·L-1）：甘油40，酵母粉5，胰蛋白胨10，乙酸鈉6，磷酸氫二鉀1.5。pH 6.5，121℃滅菌20 min。

甘油馴化培養基（g·L-1）：粗甘油（濃度視實驗要求而定），酵母粉5，胰蛋白胨10，乙酸鈉6，磷酸氫二鉀1.5。pH 6.5，121℃滅菌20 min。乳酸馴化培養基（g·L-1）：粗甘油40，酵母粉5，胰蛋白胨10，乙酸鈉6，磷酸氫二鉀1.5，乳酸（濃度視實驗要求而定）。pH 6.5，121℃滅菌20 min。發酵培養基（g·L-1）：粗甘油60，酵母粉6，胰蛋白胨10，乙酸鈉6，磷酸氫二鉀1.5。pH 6.0，121℃滅菌20 min。其中，MRS培養基用于菌種的活化和保藏。

1.5 實驗方法

粗甘油的預處理：將粗甘油與去離子水按質量/體積比1：1的比例混合，降低粗甘油的黏度，然后加入一定量的粉狀活性炭（甘油：活性炭質量比為100：1），在室溫條件下攪拌吸附3 h，攪拌結束后，抽濾除去活性炭，得到濾液即為預處理的粗甘油水溶液。

菌種活化：將4℃保藏的菌種轉接至新鮮的MRS培養基中，34℃靜置活化10 h，接種量3%（體積）。

種子培養：將活化后的菌液再接種至裝有 100 ml新鮮MRS培養基的250 ml錐形瓶中，在34℃、搖床轉速150 r·min-1下培養10 h后，獲得種子液。

搖瓶培養（代謝進化）：將甘油/乳酸馴化培養基100 ml裝于250 ml錐形瓶中，以10%（體積）的接種量接入種子液，在34℃ 、搖床轉速150 r·min-1下培養12～24 h。在培養基中添加20 g·L-1已滅菌的碳酸鈣，可緩沖搖瓶pH的變化。

5 L發酵罐發酵：發酵培養基2 L盛于5 L發酵罐中，以10%（體積）的接種量接入種子液，發酵溫度34℃，攪拌轉速250 r·min-1，發酵液pH通過自動流加5 mol·L-1的氨水控制在6.0，通入通氣比0.4的空氣保持微氧環境。每間隔一定時間取樣，檢測發酵液中甘油濃度、乳酸濃度以及菌體的生物量。

菌種保藏：直接將活化好的菌株置于血清瓶中，在 4℃條件下保存。如長期保存則需將菌液與40%的甘油溶液等體積混合，裝入菌種保藏管，在-80℃冰箱中保存。

1.6 分析方法

菌體生物量的測定采用比濁法。將發酵液適當稀釋后，以蒸餾水為空白測定其在620 nm下的吸光度值（OD620）；通過菌體干重與相應OD值的標準曲線計算出單位體積發酵液中的菌體干重。標準曲線方程為：y=0.3958x+0.0085，線性相關系數R2=0.9958，其中，x為發酵液OD值，y為單位體積發酵液菌體干重 (g·L-1)。

甘油和乳酸的測定采用高效液相色譜。色譜條件為：Aminex-HPX-87H色譜柱（Bio-rad），流動相為0.5 mmol·L-1的H2SO4溶液，流動相流速為0.5 ml·min-1，柱溫65℃，檢測器為RID-10A折光示差檢測器，檢測器溫度45℃，進樣量為20 μl。發酵液樣品經12000 r·min-1離心15 min后取上清，將上清液經過適當稀釋和 0.22 μm 濾膜過濾處理后，進行液相分析，通過各物質的峰面積與相應濃度的標準曲線進行濃度計算，乘上稀釋倍數即得各物質在發酵液中的濃度。

甘油標準曲線方程為y=3×10-6x+0.053，線性相關系數R2=0.9999，其中，x為甘油峰面積，y為甘油濃度（g·L-1）。乳酸標準曲線方程為：y=4×10-6x+0.0111，線性相關系數R2=0.9998，其中，x為乳酸峰面積，y為乳酸濃度 (g·L-1)。

2 實驗結果與討論

2.1 基于粗甘油濃度變化的代謝進化研究

將原始菌株接入 MRS培養基中活化后，再接于MRS培養基中擴增10 h，并將其記為Y-0；然后以10%（體積）的接種量接入100 ml甘油馴化培養基中，培養24 h，即為甘油馴化的第1代，將其記為YG-1（以下編號同理）；隨后將YG-1的菌液以相同的接種量接入新鮮的甘油馴化培養基中，記為YG-2。每10代作為一個批次，每個批次的前5代培養時間為24 h，后5代的培養時間縮短為12 h，以富集生長較快的突變株；批次間逐步提高發酵培養基中粗甘油濃度，每馴化10代后接入MRS培養基中保藏，分別記為 YG-10、YG-20、YG-30、YG-40、YG-50、YG-60。其中，1～10代所用甘油馴化培養基中添加50 g·L-1粗甘油，11～20代為70 g·L-1粗甘油，21～30代為90 g·L-1粗甘油，31～40代為100 g·L-1粗甘油，41～50代為120 g·L-1粗甘油，51～60代為140 g·L-1粗甘油。

圖1 YG系列馴化菌株在含不同濃度粗甘油培養基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of YG strains in medium of different raw glycerol concentrations

對通過基于粗甘油濃度變化的代謝進化所得到的菌株YG-10、YG-20、YG-30、YG-40、YG-50和YG-60（統稱YG系列菌株）進行底物（粗甘油）和產物（乳酸）的耐受性考察，并與原始菌株 Y-0進行對比：（1）將保藏的各代菌株活化后，接入種子培養基中培養10 h（至對數生長期）；（2）將配制好的不同濃度梯度甘油/乳酸馴化培養基加到蜂窩板中，每孔300 μl；（3）以10%（體積）的接種量將各代菌株的種子液加入不同的培養基中，即每孔30 μl的菌液；（4）將加好樣的蜂窩板放入Bioscreen C中考察生長曲線，設置考察溫度34 ℃，每隔1 h進行一次吸光度測定，持續時間40 h。

其中，甘油馴化培養基中，粗甘油的濃度分別為40、70、90、110和130 g·L-1；乳酸馴化培養基中，乳酸的濃度分別為0、5、10、20和 40 g·L-1。2.1.1 甘油馴化菌株的底物耐受性考察 考察 YG系列馴化菌株對底物粗甘油的耐受性（圖1）。由圖1可以看出，隨著培養基中粗甘油濃度的提高，各代菌株的生長情況都受到了一定程度的影響。將馴化各代次菌株在粗甘油濃度為130 g·L-1的甘油馴化培養基中的生長曲線進行比較（圖2）。如圖2所示，經過馴化的菌株在粗甘油濃度較高的培養基中，與出發菌株相比，可以更快地進入對數生長期，且生長速率提高。馴化到40代以后的YG-40、YG-50和 YG-60三株菌在生長情況上已經明顯優于原始菌株。在生物量方面，YG-60比出發菌株的細胞濃度提升了23%。

圖2 YG系列馴化菌株在含130 g·L-1粗甘油培養基中的生長曲線Fig.2 Growth curves of YG strains in medium containing 130 g·L-1raw glycerol

2.1.2 甘油馴化菌株的產物耐受性考察 考察 YG系列馴化菌株對產物乳酸的耐受性。隨著培養基中乳酸濃度的增加，菌體生長受到顯著抑制。當培養基中的乳酸濃度上升至40 g·L-1時，各代菌株的生長已經幾乎被完全抑制。說明YG系列菌株在乳酸耐受性上的表現與原始菌株并沒有表現出較明顯的差異。

2.2 基于乳酸濃度變化的代謝進化研究

將原始菌株接入 MRS培養基中活化后，再接于種子培養基中擴增10 h，并將其記為Y-0；然后以10%（體積）的接種量接入100 ml乳酸馴化培養基中，培養24 h，即為乳酸馴化的第1代，將其記為 YL-1（以下編號同理）；隨后將 YL-1的菌液以相同的接種量接入新鮮的甘油馴化培養基中，記為YL-2。如此連續傳代培養，每10代作為一個批次，每個批次的前5代培養時間為24 h，后5代的培養時間縮短為12 h，以富集生長較快的突變株；批次間逐步提高發酵培養基中乳酸濃度，每馴化10代后接入MRS培養基中保藏，分別記為YL-10、YL-20、YL-30、YL-40、YL-50、YL-60。其中，1～10代所用乳酸馴化培養基中添加2 g·L-1乳酸，11～20代為5 g·L-1乳酸，21～30代為10 g·L-1乳酸，31～40代為 20 g·L-1乳酸，41～50代為 30 g·L-1乳酸，51～60代為40 g·L-1乳酸。

考察YL系列馴化菌株對底物粗甘油的耐受性（圖3）。由圖3可以看出，YL系列各代菌株在不同粗甘油濃度培養基中的生長情況與原始菌株大致相當，各馴化代次表現出微小差異，但無明顯的規律性。

YL系列馴化菌株對產物乳酸耐受性考察結果如圖4所示。從圖4中可以看出，代謝進化后，YL系列菌株對乳酸的耐受性得到提升。但是在高濃度乳酸（40 g·L-1）的抑制作用下，YL系列的菌株與原始菌株類似，生長也近乎停滯。如圖4所示，在含 20 g·L-1乳酸的培養基中生長情況的對比來看，YL-50的生物量比初始菌株提升了18%。

2.3 分批發酵考察

通過利用微生物全自動生長曲線分析儀（Bioscreen C）對代謝進化得到的各代菌株進行底物和產物的耐受性考察，對它們的生長能力與耐受能力有了初步的了解。由于Bioscreen C內部的發酵液體積較小，受傳質、供氧等條件限制，菌體的生長環境與實際發酵的體系具有一定差異。因此選取了YG-30、YG-60、YL-30、YL-60四株菌進行分批發酵的考察，并與原始菌株Y-0的分批發酵結果進行比較，考察代謝進化對菌體發酵水平的影響。同時，也研究了補料分批對YL-60菌株的發酵水平影響。不同菌株的發酵動力學曲線如圖5所示，分批發酵的結果見表1。

圖3 YL系列馴化菌株在含不同濃度乳酸培養基中的生長曲線Fig.3 Growth curves of YL strains in medium containing different concentrations of lactic acid

圖4 YL系列馴化菌株在含20 g·L-1乳酸培養基中的生長曲線Fig.4 Growth curves of strains in medium containing 20 g·L-1lactic acid

從表1的結果可以看出，經過代謝進化后的各代菌株，在發酵能力上相較原始菌株有所提升。其中以粗甘油馴化至60代的菌株YG-60的批次發酵水平相對較好。主要是因為馴化菌種提高了對培養基的適應性, 在甘油濃度較高的發酵培養基中也可以獲得較高的菌濃, 從而可以為乳酸的合成提供有利條件。其乳酸產量、甘油轉化率以及生產強度分別為 45.0 g·L-1、0.989 g·g-1和 0.47 g·L-1·h-1，相對原始菌株分別提高了4.4%、1.5%和4.4%。

YG-60經過220 h的補料分批發酵，最終獲得83.8 g·L-1的乳酸濃度，比分批發酵提高了近1倍。乳酸對甘油的轉化率達到0.978 g·g-1，生產強度為0.43 g·L-1·h-1。究其主要原因在于補料分批降低了甘油對菌株的抑制作用。各馴化代次菌株的發酵動力曲線顯示乳酸是典型的生長關聯型產物，產量與菌體的生長關系極為密切。因此提高發酵菌株的生長能力是提升乳酸發酵水平的關鍵。

3 結 論

（1）研究結果顯示通過提高培養基中的粗甘油濃度對Lactobacillus pentosusR3-8進行代謝進化，可以提高其對高濃度粗甘油（130 g·L-1）的耐受性。與出發菌株相比，經過代謝進化的菌株與出發菌株相比，可以更快地進入對數生長期，生長速率提高。第 60代馴化菌株生物量比出發菌株提升了23%。

圖5 進化菌株的發酵過程曲線Fig.5 Time curves of batch cultivation of evolved strains(fed-batch cultivation)

表1 代謝進化菌株的分批發酵結果Table 1 Batch cultivation of evolved strains

（2）經過進化，菌株對乳酸的耐受性得到提升。由含20 g·L-1乳酸的培養基中生長情況的對比可知，YL-50的生物量比初始菌株提升了18%。但由于乳酸對該菌株的抑制作用比較大，在高濃度乳酸的（40 g·L-1）情況，YL系列的菌株與原始菌株類似，生長也近乎停滯。

（3）綜合馴化各代次的菌株的分批發酵結果可知，以粗甘油馴化至 60 代的菌株 YG-60 的批次發酵水平相對較好，乳酸產量、甘油轉化率以及生產強度分別為 45.0 g·L-1、0.989 g·g-1和0.47 g·L-1·h-1，相對原始菌株分別提高了4.4%、1.5%和4.4%。

（4）YG-60經過220 h的補料分批發酵，最終獲得83.8 g·L-1的乳酸濃度，比分批發酵提高了近1倍。乳酸對甘油的轉化率達到0.978 g·g-1，生產強度為0.43 g·L-1·h-1。

（5）由于Lactobacillus pentosusR3-8的遺傳性狀比較穩定，為了獲得具有更加優良發酵水平的突變株，需要延長代謝進化的代數。乳酸是典型的生長關聯型產物，乳酸的發酵水平受到菌體生長情況的影響，所以后續研究將圍繞如何提升菌株在發酵過程中的生長水平。

符號說明

Lac——發酵生成的乳酸濃度，g·L-1

QP——乳酸的生產強度/產率，g·L-1·h-1

Sf——發酵結束時甘油濃度，g·L-1

S0——發酵初始甘油濃度，g·L-1

Time——發酵時間，h

X——發酵過程中發酵液最大的細胞干重值，g·L-1

YP/S——乳酸對甘油的轉化率，g·g-1

[1] Basha S A, Gopal K R, Jebaraj S. A review on biodiesel production,combustion, emissions and performance [J].Renew Sust.Energ.Rev.,2009, 13：1628-1634.

[2] Lin L, Zhou C, Saritporn V, Shen X,et al. Opportunities and challenges for biodiesel fuel [J].Appl.Energ., 2011, 88：2020-1031.

[3] Rasal R M, Janorkar A V, Hirt D E. Poly (lactic acid) modifications[J].Prog.Polym.Sci., 2010, 35 (3)：338-356.

[4] Mazumdar S, Clomburg J M, Gonzalez R.Escherichia colistrains engineered for homofermentative production of D-lactic acid from glycerol [J].Appl.Environ.Microb., 2010, 76 (13)：4327-4336.

[5] Hong An’an (洪安安), Cheng Keke (程可可), Sun Yan (孫燕), Chen Zhen (陳珍), Peng Feng (彭楓), Liu Canming (劉燦明), Liu Dehua(劉德華). Strain screening for bioconversion of glycerol to lactic acid and optimization of culture medium [J].Microbiology China(微生物學通報), 2009, 36 (8)：1195-1199.

[6] Hong A A, Cheng K K, Peng F,et al. Strain isolation and optimization of process parameters for bioconversion of glycerol to lactic acid [J].J.Chem.Technol.Biot., 2009, 84 (10)：1576-1581.

[7] Tian Kangming (田康明), Zhou Li (周麗), Chen Xianzhong (陳獻忠),Shen Wei (沈微), Shi Guiyang (石貴陽), Suren Singh, Lu Fuping (路福平), Wang Zhengxiang (王正祥). Temperature-switched highefficiency D-lactate production from glycerol [J].Chinese Journal of Biotechnology(生物工程學報), 2013, 29 (1)：111-114.

[8] Tian Kangming, Chen Xianzhong, Shen Wei, Bernard A Prior, Shi Guiyang, Suren Singh, Wang Zhengxiang. High-efficiency conversion of glycerol to D-lactic acid with metabolically engineeredEscherichia coli[J].Afr.J.Biotec., 2012, 11 (21)：4860-4867.

[9] Hofvendahl K, Hahn-H?gerdal B. Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources [J].Enzyme Microb.Tech., 2000, 26 (2)：87-107.

[10] Zhang Xueli (張學禮). Twenty years development of metabolic engineering—a review [J].Chinese Journal of Biotechnology(生物工程學報), 2009, 25 (9)：1285-1295.

[11] Christensen B, Thykaer J, Nielsen J. Metabolic characterization of high- and low-yielding strains ofPenicillium chrysogenum[J].Appl.Microb.Biotec., 2000, 54 (2)：212-217.

[12] Madison L L, Huisman G W. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates)：from DNA to plastic [J].Microbiol.Mol.Biol.Rev., 1999, 63 (1)：21-53.

[13] Park J H, Lee K H, Kim T Y,et al. Metabolic engineering ofEscherichia colifor the production of L-valine based on transcriptome analysis and in silico gene knockout simulation [J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2007, 104 (19)：7797-7802.

[14] Jarboe L R, Grabar T B, Yomano L P, Shanmugan K T, Ingram L O.Development of ethanologenic bacteria//Olsson L. Biofuels [M].Berlin：Springer, 2007：237-261.

[15] Zhang Xueli, Kaemwich Jantama, Moore J C, Shanmugam K T,Ingram L O. Production of L-alanine by metabolically engineeredEscherichia coli[J].Appl.Microbiol.Biot., 2007, 77 (2)：355-366.

[16] Kaemwich J, Zhang Xueli, Moore J C, Shanmugam K T, Svoronosand S A, Ingram L O. Eliminating side products and increasing succinate yields in engineered strains ofEscherichia coliC [J].Biotech.Bioeng.,2008, 101 (5)：881-893.

[17] Kaemwich J, Haupt M J, Spyros A Svoronos, Zhang Xueli, Moore J C,Shanmugamand K T, Ingram L O. Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains ofEscherichia colithat produce succinate and malate[J].Biotech.Bioeng., 2008, 99 (5)：1140-1153.

[18] Lee S J, Lee D Y, Kim T Y, Kim B H, Lee J, Lee S Y. Metabolic engineering ofEscherichia colifor enhanced production of succinic acid, based on genome comparison and in silico gene knockout simulation [J].Appl.Environ.Microbiol., 2005, 71：7880-7887.

[19] Glassner D A, Datta R. Process for the production and purification of succinic acid [P]：US, 5143834. 1992.

[20] Meynial-Salles I, Dorotyn S, Soucaille P. A new process for the continuous production of succinic acid from glucose at high yield,titer, and productivity [J].Biotech.Bioeng., 2007, 99 (1)：129-135.

[21] Zhao Geng (趙耿). Study on the production of lactic acid by bioconversion of waste glycerol [D]. Quanzhou：Huaqiao University,2010.