內蒙古4種白粉菌的ITS序列分析

文靜　劉鐵志　趙冰

摘要：采用chelex-00法提取內蒙古地區4種白粉菌的基因組DNA，擴增其rDNA內轉錄間隔區序列ITS，連接載體測序，并基于ITS序列進行親緣關系分析。結果表明，4種白粉菌形成3個進化距離較遠的分支；寄生在豌豆和田旋花上的豌豆白粉菌和旋花白粉菌的ITS序列緊密聚在支，其親緣關系較近，同屬白粉菌屬；寄生在紫花苜蓿上的托羅斯內絲白粉菌和寄生在山桃上的三指單囊白粉菌各自成支，與形態學分類結果相一致。ITS序列可用于內蒙古地區白粉菌分類鑒定研究。

關鍵詞：白粉菌；內轉錄間隔區；親緣關系；內蒙古；序列分析

中圖分類號： S43244文獻標志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0050-03

白粉菌（powdery mildews）是重要的植物病原菌，目前至少報道了25個屬873種，其中，有性型6個屬，無性型9個屬，由白粉菌引起的植物病害統稱為白粉病。白粉病在世界各地均有發生，寄主植物至少有 67屬9 838種被子植物[2]。近年來，我國由于玻璃溫室、塑料大棚和密植等栽培模式和耕作制度的改變，為作物白粉病的發生創造了良好的環境，常常造成瓜果、蔬菜和花卉等白粉病的大流行，白粉病發生相當普遍和嚴重，給農業生產帶來重大的經濟損失。在許多地區，如芍藥、醉蝶花、荷蘭菊等觀賞花卉白粉病的發病率幾乎達到00%，林木和牧草白粉病更是隨處可見。

內蒙古自治區是典型的的中溫帶季風氣候地區，植物種類復雜多樣，為專性寄生的白粉菌提供了優越的生長發育條件，通過經典分類方法已鑒定出白粉菌0屬23個種和變種，寄主植物多達58科2屬400多種和變種[3]。農業是內蒙古的主要產業之一，為避免白粉菌對農業造成的經濟損失，對內蒙古自治區農作物白粉菌進行系統分類研究很有必要。近幾年，隨著分子生物學的發展，對白粉菌系統分類研究已由傳統的經典分類向分子生物方法分類過渡。本試驗對內蒙古自治區采集的白粉菌樣本進行rDNA-ITS序列分析及比對，構建白粉菌系統發育樹，從分子系統學角度探討不同白粉菌之間的親緣關系，以期為白粉菌的分類鑒定及系統發育等方面的研究提供依據，為該地區植物白粉病的有效防治及物種多樣性的研究提供科學依據及資料。

材料與方法

菌種樣本采集

在內蒙古自治區采集4種白粉菌樣本，寄主分別是豌豆（標本號：CFSZ 559）、田旋花（樣本號：CFSZ7249）、紫花苜蓿（樣本號：CFSZ7253）、山桃（樣本號：CFSZ7257），保存于赤峰學院生命科學學院菌物實驗室。

2白粉菌孢子收集

白粉菌是專性寄生菌，只在活體寄主上生存，因此，將病菌樣本盡快帶回實驗室，在新鮮寄主植物表面，用滅菌的解剖針在顯微鏡下挑取大概數百個分生孢子，將其置于5 mL離心管中-20 ℃冰箱中保存，以備提取基因組DNA。

3主要試劑

[3]Chelex-00，購自美國伯樂公司；Taq酶、XbalⅠ、Hind Ⅲ、質粒DNA提取試劑盒、CR產物純化試劑盒和pMD 8-T Vector，均購自大連寶生物公司；通用引物ITS：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′、ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′、ITS6：5′-AGGTAATCCCGGTTGGTTTC-3′[4]，均由大連寶生物公司合成。

4白粉菌基因組DNA的提取

選取數百個分生孢子置于5 mL離心管中，加入50 μL 5% Chelex-00，56 ℃溫育數小時；渦旋振蕩儀劇烈振蕩，沸水浴8 min；再次劇烈振蕩，5 000 g離心5 min；上清移入另一離心管中，-20 ℃保存備用[5]。

5ITS序列的CR擴增

采用巢式CR方法，以提取的基因組DNA作為模板進行CR擴增。一次CR總體積為50 μL，反應參數為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環30次；72 ℃ 0 min。二次CR總體積為50 μL，反應參數為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環30次；72 ℃ 0 min。將CR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

6CR產物的克隆及序列測定

CR產物的回收與純化參照TaKaRa DNA Fragment urification Kit試劑盒說明進行，并與 pMD 8-T 載體連接轉化于DH5α感受態細胞，用CR法和 XbalⅠ、Hind Ⅲ雙酶切法篩選陽性克隆菌株，送大連寶生物生物技術有限公司測序。

7ITS序列的生物信息學分析

利用Clustal X程序將4種不同植物白粉病菌的ITS序列匹配排列，用MEGA 60軟件對序列進行比對分析，基于kimura-2-parameter雙參數模型，采用鄰近距離法（N法）構建系統進化樹以推演系統發生關系，同時，采用bootstrap法，經000次循環檢驗系統進化樹的可靠性。

2結果與分析

2CR擴增結果

[2]由圖、圖2可見，采用真菌通用引物ITS5和ITS6作為外引物，ITS和ITS4作為內引物，對4種白粉菌基因組DNA進行擴增，均得到600 bp左右的DNA片段。測序結果表明，該片段包括了完整的核糖體內轉錄間隔區ITS和ITS2序列、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。

22白粉病菌ITS序列分析和進化樹的構建

將已測得的序列去掉5′和3′端的載體序列，得到4種白粉菌的ITS序列，用Clustal X軟件中Alignment程序對ITS序列進行多重比對，結果由表、圖3可見，4種白粉菌部分8 S rDNA、全部58 S rDNA序列和部分28 S rDNA序列非常保守，而內轉錄間隔區ITS和ITS2序列變化較大。基于ITS序列，利用MEGA 60對4種白粉菌進行系統發育分析和進化樹的構建，由圖4可見，4種白粉菌形成3個進化距離較遠的大分支；寄生在豌豆（CFSZ 559）和田旋花（CFSZ7249）上的白粉菌遺傳距離較小，親緣關系較近，其ITS序列緊密聚在支；寄生在紫花苜蓿（CFSZ7253）上的托羅斯內絲白粉菌和寄生在山桃（CFSZ7257）上的三指單囊白粉菌各自成支，ITS序列分析結果與其在形態學上的分類結果相一致。

3結論

本研究對來自于內蒙古自治區不同屬的4種白粉菌進行ITS序列克隆，已成功克隆出白粉菌的ITS序列包括內轉錄間隔區ITS和ITS2、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。通過序列對比分析發現，部分8S rDNA、全部58S rDNA序列和部分28S rDNA序列核糖體編碼區非常保守，適合親緣關系較遠的類群分析[6]，而ITS和ITS2變化較大，可用于親緣關系較近類群的分析。基于ITS序列比對，利用MEGA 60對4種白粉菌進行系統發育分析和進化樹的構建，內蒙古自治區4種白粉菌種屬間親緣關系的結果與傳統的形態學分類結果相一致，這表明ITS序列可用于白粉菌屬內和屬間的親緣關系和分類分析。

本研究獲得了一種通過擴增ITS序列進行親緣關系和分類分析快速而有效的方法，這為內蒙古自治區白粉菌分子系統學的研究和植物白粉病的防治，提供了理論參考和相關依據。

[HS2][HT85H]參考文獻：[HT8SS]

[ZK（#]Braun U，Cook R A Taxonomic manual of the erysiphales（powdery mildews）[M] Utrecht：CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre，202：-707

[2]Amano K Host range and geographical distribution of the powdery mildew fungi [M]2nd ed Tokyo：apan Scientific Societies ress，986

[3]劉鐵志 內蒙古白粉菌志[M] 呼和浩特：內蒙古科學技術出版社，200：-322

[4]Takamatsu S，Limkaisang S，Braun U hylogenetic relationships and generic affinity of Uncinula septata inferred from nuclear rDNA sequences Mycoscience，2005，46（）：9-6

[5][2]Hirata T，Takamatsu S Nucleotide sequence diversity of rDNA internal transcribed spacers extracted from conidia and cleistothecia of several powdery mildew fungi Mycoscience，996，37（3）：283-288

[6]Bruns T D，White T ，Taylor W Fungal molecular systematics Annual Review of Ecology and Systematics，99，22：525-564