巧克力中乳脂肪的鑒別及含量測(cè)定

李 蕊 徐小明

（1.浙江省血液中心檢測(cè)中心 浙江 杭州 310052；2.浙江省疾病預(yù)防控制中心理化檢驗(yàn)所 浙江 杭州 310051）

1 引言

由于技術(shù)和經(jīng)濟(jì)等方面的原因，很多巧克力產(chǎn)品中部分可可脂被其他物質(zhì)取代［1］，如乳脂肪、代可可脂、類可可脂等。我國(guó)于2004年7月起正式執(zhí)行的《巧克力及巧克力制品》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定巧克力中非可可植物脂肪的添加量不得超過(guò)5%［2］，但該標(biāo)準(zhǔn)缺乏具體的檢測(cè)方法，只能根據(jù)廠家提供的原始配料進(jìn)行估算。因此要通過(guò)檢測(cè)巧克力中脂肪酸特點(diǎn)來(lái)達(dá)到測(cè)定非可可植物脂肪的目的，首先應(yīng)排除乳脂肪對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。

對(duì)此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，主要集中在對(duì)巧克力中甘油三酯和脂肪酸的檢測(cè)兩個(gè)研究方向。ISO 23275－1和ISO 23275－2［3］中公布了通過(guò)檢測(cè)甘油三酯來(lái)對(duì)黑巧克力中摻入的類可可脂含量進(jìn)行檢測(cè)的方法，但由于乳脂肪中的甘油三酯會(huì)對(duì)類可可脂的定量測(cè)定起到干擾作用，因此這種方法不適用于牛奶巧克力的檢測(cè)。也有學(xué)者通過(guò)測(cè)定乳脂肪中的丁酸及其與肉豆蔻酸、棕櫚酸的比率來(lái)測(cè)定乳脂肪的含量［5］，但由于丁酸具有不穩(wěn)定性，會(huì)隨時(shí)間和環(huán)境的變化發(fā)生量的變化，因而可能造成定量不準(zhǔn)確。本研究通過(guò)測(cè)定乳脂肪中的脂肪酸發(fā)現(xiàn)C14：1僅在乳脂肪中存在，且在各種乳脂肪中含量穩(wěn)定，是很好的鑒別標(biāo)準(zhǔn)物。同時(shí)本方法通過(guò)較為簡(jiǎn)便的計(jì)算方法即可達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的，不失為一種檢測(cè)巧克力中乳脂肪含量的可行方法，并為進(jìn)一步測(cè)定巧克力中非可可植物脂肪的含量奠定了基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料：儀器與試劑Agilent 6890N 氣相色譜儀，7683自動(dòng)進(jìn)樣器，HP ChemStation 化學(xué)工作站（美國(guó)安捷倫公司）；分析天平AL104－IC（梅特勒－托利多儀器有限公司）；旋渦混合器WH－861（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Laborota 4003Control（德國(guó)Heidolph 公司）；電熱恒溫干燥箱ED－53（德國(guó)Bindent GmbH 公司）；微量移液器（瑞士SOCOREX 公司）。試劑：甲醇、乙醇、正己烷、無(wú)水乙醚、，均為色譜純，氫氧化鉀、氯化鈉均為分析純，氨水、2mol／L 鹽酸甲醇溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配置：量取1ml 10.0mg／ml的37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷定容于10ml棕色容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1000 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－20℃下保存。取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用正己烷稀釋配制所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，密封，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 色譜條件：選用CP－Sil 88FAME 毛細(xì)管石英柱（100in×0.25Inm×0.20m），F(xiàn)ID 檢測(cè)器，載氣為高純氮?dú)猓鶞?0℃保持2min后以15℃／min升溫到100℃，再以4℃／min升溫到230℃保持15分鐘；進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器溫度280℃，分流比1：5；載氣流量1.5ml／min。

2.3.2 脂肪酸提取方法：準(zhǔn)確量取液體試樣10ml，加入2ml氨水，置于65℃水浴15min，取出輕搖，冷至室溫，在制備好的樣品中加入10 ml乙醇，混勻。加入12.5ml無(wú)水乙醚，加塞振搖1min。在加入12.5ml正己烷，加塞振搖1min，靜置、分層，有機(jī)相轉(zhuǎn)入磨口平底燒瓶中，重復(fù)操作兩次。合并抽提液于磨口平底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干。

2.3.3 脂肪酸的甲酯化：準(zhǔn)確稱取10mg（精確至0.1mg）提取樣品，加入0.7ml 1mol／L的KOH／CH3OH 溶液，混勻，置于60℃水浴中振蕩3min，待冷卻至室溫，加入1ml 2mol／L 的HCl／CH3OH 溶液，混勻，置于50℃烘箱中反應(yīng)15min后，待冷卻至室溫，加入3ml飽和NaCl溶液，1ml正己烷，混勻，離心，取上清液待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 巧克力中乳脂肪的定性鑒別：通過(guò)對(duì)乳脂肪、可可脂、類可可脂、月桂酸型代可可脂、非月桂酸型代可可脂及各種植物油的脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)C14：1只存在于乳脂肪中，見(jiàn)圖1，且C14：1／C12：0的范圍在0.2～0.3之間，通過(guò)對(duì)其中各種脂肪酸含量特點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，兩種代可可脂中C14：1和C12：0 的含量與乳脂肪和可可脂相差較大，因此根據(jù)C14：1／C12：0的范圍較容易將加入了代可可脂的牛奶巧克力鑒別開(kāi)來(lái)，而類可可脂中C14：1和C12：0的含量與可可脂極為相似，因此還不能鑒別牛奶巧克力中加入了類可可脂的情況。見(jiàn)表1。

表1 油脂中C12：0及C14：1的含量及其比值

圖1 純可可脂、乳脂肪、月桂酸型代可可脂、類可可脂疊加色譜圖

3.2 乳脂肪的定量檢測(cè)：通過(guò)按5%、10%、15%、20%和30%的比例向純可可脂中摻入乳脂肪，得到各種脂肪酸的線性方程，根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)對(duì)定量方程進(jìn)行篩選。首先，從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，同一種脂肪酸的含量在不同乳脂肪和可可脂中存在一定的差異，為了削弱這種差異而達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的，需選擇相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差較小的指標(biāo)，因此將C14：0這一指標(biāo)排除。其次，在相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差滿足條件的同時(shí)應(yīng)考慮選擇線性相關(guān)性好的指標(biāo)，據(jù)此將C16：0 這一指標(biāo)排除。最終確定C14：1、C16：1 和C18：0這三個(gè)指標(biāo)為計(jì)算巧克力中乳脂肪含量的指標(biāo)，可以通過(guò)這一系列線性方程分別求出加入的乳脂肪的量，再求其平均值作為乳脂肪的加入量。同時(shí)我們也對(duì)這三個(gè)定量方程的準(zhǔn)確性做了進(jìn)一步的驗(yàn)證，見(jiàn)表3。用其對(duì)三個(gè)不同的模擬組進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果的相對(duì)誤差在0.5%～26%之間，能夠滿足檢測(cè)的要求。

表2 乳脂肪和可可脂中五種脂肪酸成分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及線性回歸方程

表3 模擬摻偽巧克力中乳脂肪測(cè)量值與真值比較

從定性的結(jié)果來(lái)看我們不能將加入了類可可脂的牛奶巧克力鑒別開(kāi)來(lái)，因此我們對(duì)加入類可可脂的情況也進(jìn)行了模擬，向含有一定量乳脂肪的可可脂中分別加入5%和10%的類可可脂，見(jiàn)表3。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以看出，在加入類可可脂的情況下，運(yùn)用上述三個(gè)指標(biāo)對(duì)其中加入乳脂肪的量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果也是可以滿足檢測(cè)要求的。這樣就實(shí)現(xiàn)了對(duì)非代可可脂巧克力中乳脂肪含量的準(zhǔn)確檢測(cè)。

當(dāng)C14：1／C12：0的比值超出0.2～0.3這個(gè)范圍時(shí)，說(shuō)明巧克力中有代可可脂的加入，此時(shí)對(duì)乳脂肪含量的檢測(cè)只能用C14：1的定量方程對(duì)其進(jìn)行計(jì)算。

4 小結(jié)

雖然飼料、地域、季節(jié)等因素會(huì)使牛奶中乳脂肪的某些成分存在一定的差異，但仍有一部分脂肪酸所占的百分含量比較穩(wěn)定，本研究較好的利用了這一特征，成功的建立了一種檢測(cè)巧克力中乳脂肪含量的氣相色譜方法。并且本方法具有易于操作、計(jì)算方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步檢測(cè)巧克力中非可可植物油的含量打下了良好的基礎(chǔ)。

［1］ Lippm，Anklame.Review of cocoa butter and alternative fats for use in chocolate－part A.Compositional data.Food Chemistry，1998，62（1）：73－97

［2］ GB－T 19343－2003 巧克力及巧克力制品［S］.

［3］ ISO 23275－1.Animal and vegetable fats and oils－Cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate－Part 1：Determination of the presence of cocoa butter equivalents.2006

［4］ ISO 23275－2.Animal and vegetable fats and oils－Cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate－Part 2：Quantification of cocoa butter equivalents.2006

［5］ MUUSE B，MARTENS R.Mixtures of milk fat with non－milk fat－Determination of the milk fat content［J］.Int.Dairy Fed.Bull.1993，285：65－69