隱匿性乙型肝炎病毒感染研究進展*

陳建宏，劉妍，李進 綜述，徐東平 審校

傳統的觀點認為血清HBsAg的轉陰和抗-HBs的出現是HBV完全清除的標志。1978年，Hoofnagle et al[1]發現HB-sAg陰性，抗-HBc陽性的供血者可使受血者發生HBV感染，提出了隱匿性感染的存在，但由于當時病毒檢測技術的限制，這種觀點一直頗受爭議。隨著病毒檢測技術的進步，特別是PCR（Polymerase Chain Reaction）技術的不斷成熟，不少研究證實了OBI的存在。根據其血清學特征可將OBI分為血清學陽性和血清學陰性兩類，血清學陽性的患者是指抗-HBc陽性伴或不伴抗-HBs陽性，血清學陰性患者所有的HBV血清標志物都是陰性。本文將從流行病學特點、發病機制、臨床轉歸和診斷治療等方面對OBI進行系統的闡述。

1 隱匿性HBV感染的流行病學特點

OBI的發生率與不同國家、不同地域的HBV的流行率相關，在發展中國家發生率高，在西方發達國家發生率低；在HBV高發區較常見，在HBV暴露率低的地區則很少發生。例如在在巴西亞馬遜地區，3600名獻血者中有8名為OBI[2]，而在荷蘭，440萬份獻血標本中，只有23份可以檢測到HBV DNA[3]。

OBI的流行率還與所選取的研究人群有關。慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染者中OBI的發生率比其他慢性肝臟疾病高。在非腸道給藥的人群中，OBI的發生率較高，在血友病患者為7.8%[4]，在血液透析者為14.7%[5]。肝細胞癌（HCC）患者中OBI的發生率較高，特別是在不明原因的HCC患者中，其發生率高達73%[6]。研究樣本的血清學表現也會影響OBI的發生率，在對北美因紐特人社區的研究中發現，HBsAg陰性者中有既往感染HBV血清學表現者和無既往感染血清學表現者OBI的發生率分別為18%和8.1%[7]。此外，樣本量的大小和一些未知的混雜因素也會影響OBI的發生率。

Ireland et al[8]用7種不同的試劑盒檢測13種突變株在體外表達的抗原，其結果不盡相同，這說明不同檢測方法的靈敏性和特異性也會影響OBI的發生率。

2 隱匿性HBV感染的發生機制

OBI的發生機制尚未完全明確，可能有多種因素參與其中，下面我們將根據現有報導從HBV自身因素、宿主因素以及共同感染等方面對OBI的發生機制進行系統的闡述。

2.1 HBV低水平復制和表達研究發現，急性肝炎HBsAg轉陰后10年以上，從患者的血清、肝組織或者外周血淋巴細胞中仍能檢測到HBV DNA，但均處于較低的水平，并且體內一直存在較強的HBV特異性T細胞免疫反應[9]，提示即使HBsAg轉陰多年后，HBV并不一定能被機體完全清除，而是在機體免疫系統的壓力下處于一種極低的復制和表達水平，現有的常規檢測技術無法檢測到。長期抗病毒治療導致的RT區耐藥突變也可以導致HBV復制力降低，也可能導致OBI的發生。

2.2 HBV整合 HBV侵入人體后可以整合到宿主DNA上，特別是在肝癌患者，85%～90%的HCC患者的DNA中可以發現整合的HBV DNA，并且大多是以不完整的DNA片段的形式整合到宿主DNA的不同位置[10]，破壞了HBV和宿主基因組的完整性，導致HBsAg不表達或無法被識別，從而形成OBI狀態，這也可能是HCC患者中OBI發生率較高的原因。

2.3 HBV S基因變異 S基因變異主要是通過影響HBsAg的表達、分泌和識別等機制導致OBI的發生。a決定簇（aa121-147）是HBsAg上相對保守的區域，是宿主免疫反應識別的主要位點，其間的一些點突變如C124Y，D144A等可以降低HBsAg的抗原性，導致表達的HBsAg無法被現有的試劑盒識別；親水區的一些變異如I126S，Q129R，G145R等能損害病毒或表面抗原的分泌，使其無法從內質網上釋放到血清中，形成OBI狀態[11，12]；Pre-S區的缺失突變可以影響HBsAg的表達導致OBI的發生[13]；糖基化修飾可以保護抗原免受抗體的攻擊，親水區內的新發糖基化位點可以通過模擬B細胞表位的作用干擾HBsAg的識別，從而形成OBI狀態[14]。

2.4 HBV潛伏于PBMCs急性或者慢性乙型肝炎HBsAg轉陰后，仍可以從患者的PBMCs中發現HBV DNA，研究發現HBV相關疾病的患者在肝移植后接受大量的抗-HBS治療，其血清中的HBsAg和肝組織中的HBV DNA都轉陰，但是在其PBMCs中仍可檢測到HBV DNA，這提示PBMCs可能是OBI患者HBV持續低水平復制的場所。Coffin et al[15]發現感染急性WHV的土撥鼠血清學轉陰后仍可以從PBMCs中檢測到WHV DNA，WHV和HBV的分子特性和病理學特性十分相似，因此從動物實驗的角度很好的證明了上述觀點。

2.5 宿主的免疫因素 研究發現一旦病毒被從宿主的肝組織微環境中分離出來，它的復制，轉錄和蛋白合成功能可以完全恢復，這有力的證明了宿主免疫系統對病毒活動的影響[16]。HBV感染的結局與病毒的復制力和機體的免疫狀態之間的相互作用有關，當機體的免疫功能足夠強時，可以將病毒完全清除，相反，如果病毒的復制力相對較強，免疫系統只能將其抑制在較低的復制水平，但無法將其完全清除，形成OBI狀態[16]。OBI獻血者血液中的HBV特異性T細胞應答，要比不活躍的攜帶者強很多[9]，這可能是因為被免疫系統抑制但又沒有完全清除的HBV仍能合成微量的抗原，低于現有方法的檢測下限，但是達到了刺激特異性T細胞反應的閾值。固有免疫因子如IFN和TNF-α在病毒的復制控制中也起到一定的作用[17]，特別是在那些獲得性免疫功能較差的OBI患者。

2.6 宿主的表觀遺傳因素表觀遺傳因素主要是通過對HBV DNA的甲基化和cccDNA上組蛋白的乙酰化來發揮作用。HBV DNA表面抗原啟動子區域的CPG島的甲基化可以導致基因沉默[18]，從而使HBsAg不表達。Vivekanandan et al[19]的研究發現將重組的甲基化的HBV DNA體外轉染肝癌細胞，HBsAg的表達降低90%。另有研究研究發現結合到細胞核內的cccDNA上的組蛋白H3、H4的乙酰化狀態調控著HBV的復制，乙酰基轉移酶的水平與病毒體外復制的水平平行，而組蛋白脫乙酰化酶的上調與體外病毒的低復制力和體內的低病毒血癥有關[20]。機體通過上述兩種表觀遺傳機制調控HBV的復制和表達，可能是OBI的形成機制之一。

2.7 共同感染除了HBV自身因素和宿主因素以外，共同感染的微生物也可以抑制HBV的活動，促進OBI狀態的形成。這一現象在HCV患者最常見，Cacciola et al[21]對200例HBSAg陰性的HCV患者的血清或肝組織進行檢測，66例可以檢測到HBV DNA，而50例HBSAg和HCV標志物都陰性的患者中，只有6例可以檢測到。HCV核心蛋白可能在這一過程中發揮直接的作用，它可以與反式激活因子HBx結合抑制HBV的表達，也可以與HBV聚合酶形成復合體，抑制其復制[22]，也有研究認為共同感染的HCV是通過調節固有免疫或適應性免疫間接的導致OBI的形成[23]。其它微生物如曼氏血吸蟲對HBV也有較強的抑制作用[24]，共同感染時可使患者表現為OBI狀態。

3 隱匿性HBV感染的臨床意義

3.1 OBI的傳播 OBI是乙型肝炎傳播鏈上不可忽視的傳染源，患者可以通過輸血、肝移植或者分娩的方式進行傳播，使受者感染HBV。在輸血或肝移植引起的HBV患者體內可以發現與捐獻者相同的HBV基因組[25，26]。在西方等發達國家，由于HBV的流行率低，并且大多采用聯合HBsAg與抗-HBc或HBV核酸檢測的方法來篩查獻血者，輸血后肝炎發生率已經非常低，但在某些發展中國家，由于HBV的高度流行，并且仍采用檢測HBsAg的方法來篩查獻血者，輸血后肝炎的發生率相對較高。并不是所有的受血者都會發生HBV感染，宿主的免疫功能、輸血量和OBI患者的病毒載量會影響其發生率。在美國，為了預防肝移植引起的傳播，抗-HBc陽性的捐獻者的器官只被用于十分緊急的情況，但是在HBV高發的地區，由于器官的短缺，這種做法是不切實際的。OBI患者還可以通過垂直傳播的方式使子代感染HBV，Pande et al[27]對222名接種過重組乙肝疫苗的新生兒（其母親均為HBsAg陽性）進行18周的隨訪，發現6/222（3%）發展成顯性HBV感染，142/222（64%）發展成OBI，提示乙肝疫苗接種可以預防顯性HBV感染的垂直傳播，但可能無法阻斷OBI的傳播。

3.2 OBI的復燃宿主的免疫系統功能在OBI的發生過程中起到關鍵的作用，免疫功能正常時可以將HBV抑制在一種極低的復制和表達水平，當OBI患者在免疫功能低下或者接受免疫抑制治療時，免疫系統無法抑制相對復制力較強的病毒株，HBV DNA可以復燃，恢復正常的復制和表達，重現經典的血清學表現[28]。預防性的抗HBV核苷酸類似物治療可以預防正在接受免疫抑制治療的HBsAg陽性的乙肝患者的DNA活化，但能否在OBI患者身上應用防止其復燃還是個有爭議的問題。

3.3 OBI與肝臟疾病的進展 OBI能加速肝臟疾病的進展，特別是在HCV患者，Squadrito et al[29]對伴有OBI的HCV患者和HCV單獨感染者進行11年的隨訪調查發現肝硬化的發生率分別為33.3%和13.5%。雖然OBI患者引起的炎癥反應很輕，但是長期持續的炎癥反應引起肝的壞死性炎癥，促進慢性肝炎向肝硬化進展，最終發展為HCC[30]。還有研究表明OBI可以降低HCV患者對干擾素的反應，從而使HCV患者的病情進展加快[31]。針對HBV的免疫反應如細胞毒T淋巴細胞介導的免疫反應也可以加快肝臟疾病的進展。HBsAg分泌障礙，大量堆積在內質網中導致內質網壓力升高，造成肝細胞的持續損傷，也可能是OBI加快肝臟疾病的進展的原因之一。

3.4 OBI與HCC許多研究發現OBI與HCC的發生有很強的相關性，到底OBI只是HCC發生的輔助因素還是獨立的危險因素呢？來自日本的兩個研究給出了我們答案，一個研究對82名HBsAg和HCV陰性的肝硬化患者進行隨訪，經過5年的隨訪HBV DNA陽性和陰性患者的腫瘤發生率分別為27%和11.8%，經過10年的隨訪，HBV陽性組全部發生肝癌，HBV陰性組腫瘤的發生率為27%[30]；另一個研究發現用干擾素將HCV感染消除后，OBI仍能導致肝癌的發生[32]。這很好的證明了OBI是HCC發生的獨立危險因素。

HBV被認為通過直接或者間接的機制發揮著它的前致癌基因的作用。OBI患者長期持續的HBV感染引起的壞死性炎癥，促進慢性肝炎向肝硬化進展，間接的加快了HCC的發生；OBI患者的HBV能整合到宿主的基因組中，使宿主基因組或者HBV自身發生改變，有著直接的致瘤作用。HBV的整合是隨機的，它可以破壞宿主基因組維持染色體穩定的調控機制導致宿主基因組的高度不穩定，引起宿主基因功能的改變，引起原癌基因的表達上調或者抑癌基因的表達下調，例如：P53，Rb，cyclins和 Ras，最終導致腫瘤的發生[33]，也可以導致自身的功能發生變化，主要是導致HBx或者Pre-S/s的改變，產生截斷或者變異的蛋白，這些蛋白可能會擾亂宿主基因的表達調控機制或者激活致癌信號通路，從而導致腫瘤的發生[34]。這種基因的重排導致的病毒或者宿主基因的變異導致了腫瘤的發生。OBI患者的一些基因突變也有直接的致癌作用，研究發現OBI患者基因組的Pre-S2（M1I和Q2K）和增強子Ⅱ的G1721A在伴有OBI的腫瘤患者的發生率比其他HCC患者高[35]。

4 隱匿性HBV感染的診斷和臨床應對措施

OBI患者是潛在的傳染源，早期診斷可以減少其傳播并且可以及時采用相應的治療措施，控制和延緩病情的進展。

研發高靈敏度和特異度的HBsAg檢測試劑盒，使用巢式PCR和實時PCR等高敏感性和特異性的方法對核酸進行檢測，對降低OBI的誤診和漏診有很大的作用。用新鮮的肝組織進行檢測也會提高HBV DNA的檢出率，在取不到肝組織的情況下，可以增加提取DNA的血清量，至少從1ml的血清中提取，并且連續多次檢測縱向血清，可以增加HBV DNA的檢出率[26]。在有不明原因肝損害的患者，抗-HBc的存在有一定的診斷意義[15]，為了減少傳播的可能性，盡量不用該類患者的血液，組織或者器官進行移植，對這類患者進行免疫抑制治療時也要十分謹慎。關于OBI患者是否要采用預防性的抗病毒治療目前仍存在很大的爭議，持續低水平的HBV DNA會加快肝臟疾病的進展，但是長期的抗病毒藥物治療也勢必會對肝功能造成一定的損害，二者的利弊需要大量的臨床實踐和回顧研究來衡量。免疫系統與HBV相互作用是OBI形成的主要原因，免疫力的消弱可誘發肝炎的復燃，因此在對抗-HBc陽性的HBV既往感染者應用免疫抑制劑時應考慮使用抗HBV藥物預防肝炎復燃，而研發和應用增強抗HBV免疫應答力的藥物是清除HBV感染的另一個重要途徑。

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