CaM 與ZmCCaMK 相互作用參與BR 誘導的玉米葉片抗氧化防護

管 莉， 張阿英

(南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京210095)

油菜素內酯(Brassinosteroids，BR)作為一種新型甾醇類植物激素，參與并調節植物生長發育以及對脅迫響應過程［1-3］。許多研究結果表明，BR 可以通過提高植物的抗氧化防護酶活性來增強植物對脅迫的耐受能力［4-5］，活性氧、促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)［5-6］、鈣調素依賴的蛋白激酶(Calcium-calmodulin dependent protein kinase，ZmCCaMK)等都參與BR 誘導的抗氧化防護，然而關于BR 誘導植物抗氧化防護的詳細機理還不十分清楚。

近些年一些研究結果表明，鈣調素(Calmodulin，CaM)也參與了植物對多種環境刺激和脅迫的響應機制，如鹽脅迫、干旱脅迫等［7-8］。Desikan等［9］研究發現外源H2O2可以誘導CaM 基因的表達。外源脫落酸(Abscisic acid，ABA)、H2O2或者水分脅迫都可以顯著提高玉米葉片中CaM 含量，而且CaM 抑制劑試驗結果也表明CaM 參與ABA 誘導的抗氧化防護［10］。但CaM 是否參與BR 誘導的抗氧化防護過程還不清楚。因此，本試驗以玉米農大108 為材料，研究CaM 在BR 誘導的抗氧化防護中的作用，并且進一步研究CaM 和ZmCCaMK 在BR誘導的抗氧化防護過程中的關系，以期深入了解BR誘導抗氧化防護機制，為進一步了解植物在抗逆過程中的響應機理提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

玉米農大108 購自中國種子公司，瞬時表達載體 pXZ-ZmCCaMK 由本實驗室馬芳芳構建，ZmCCaMK抗體由金斯瑞公司制備。

PEG4000、甘露糖醇、三氟乙酸、KI、2-(N-嗎啉)-乙磺酸(MES)、N-(6-氨基己烷基)-5-氯-1 萘-黃胺［N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalene sulphonmide hydrochloride，W7］和三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP)為Sigma 公司產品;離析酶R-10、纖維素酶R-10 為日本Yakult Honsha 公司產品;反轉試劑盒、定量試劑盒、ELISA 購自TaKaRa 公司;RNA 干擾試劑盒購自Promega 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植株培養和處理 將玉米幼苗置于光照恒溫箱中(晝夜溫度28 ℃/22 ℃，每天光照14 h，相對濕度60%)培養7 d。然后，挑選長勢一致的玉米幼苗，參照Ma 等的方法［11］，用CaM 拮抗劑W7(200 μmol/L)、TFP(100 μmol/L)預處理4 h，再用BR 處理30 min，取第2 片葉子并置于液氮中備用。另外，將玉米種子置于蛭石-泥炭土(1∶ 1)中，并在暗培養箱中培養，當第2 片葉高出第1 片葉10 ～15 cm 時，從基部剪取第2 片葉，用于玉米原生質體的提取。

1.2.2 dsRNA 的體外轉錄合成 參照Ma 等的方法［11］合成ZmCCaMK 的dsRNA。

1.2.3 玉米原生質體的分離和轉化 參照Zhu 等的方法［4］，提取玉米原生質體。玉米原生質體的轉化是采用聚乙二醇(40% PEG4000)融合法。將高純度的重組質粒100 μg ubi-YFP-ZmCCaMK (以空載ubi-YFP 為對照)或者150 μg dsRNA (以雙蒸水為對照)加入到1 ml 原生質體中，再加入1. 1 ml PEG 溶液(0.6 mol/L 甘露 醇，40% PEG4000，0.1 mol/L CaCl2)，輕輕混勻，25 ℃靜置13 ～15 min;加入4.4 ml W5 溶液(125 mmol/L CaCl2，154 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES，pH 5.7)混勻，1 000 g 離心3 min，棄上清;加1 ml 培養液(0.6 mol/L 甘 露 醇，4 mmol/L MES，4 mmol/L KCl，pH5.7)，25 ℃培養過夜;用10 nmol/L BR 處理30 min 后，收集玉米原生質體，以測定CaM 含量。

1.2.4 葉片總RNA 的提取及cDNA 的制備 將0.1 g 玉米葉片用液氮充分研磨，并溶于RNA 提取試劑Trizol 中，然后參照Ding 等的方法［12］進行總RNA 的提取及RNA 濃度和純度的檢測。最后，將提取得到的RNA 按照反轉試劑盒的說明將RNA 反轉錄成cDNA。

1.2.5 定量RT-PCR 及數據處理 應用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 對ZmCCaMK基因進行相對定量RT-PCR 分析:采用SYBR ?Premix Ex TaqTM試劑盒，以ZmACTIN 為內參引物。ZmCCaMK (DQ403196)的引物序列:5'-CTCAAGCCCGAGAACTGCC-3' 和5'-TGGCAGCCGAGACATCC-3';ZmACTIN (J01238)的引物序列:5'-GTTTCCTGGGATTGCCGAT-3' 和 5'-TCTGCTGCTGAAAAGTGCTGAG-3'。反應體系和反應程序參照試劑盒說明。每個樣品重復3 次，取平均值，用2-△△Ct的方法計算待測基因的相對表達量，其中，基因在各處理0 min 時的相對表達量設定為1.0。

1.2.6 免疫沉淀和激酶凝膠反應 將處理后的葉片用液氮研磨成粉末，加入1 ml 蛋白質提取液［100 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)pH 7. 5，5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5 mmol/L 乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，10 mmol/L 二硫蘇糖醇，10 mmol/L Na3VO4，10 mmol/L NaF，50 mmol/L β-磷酸甘油，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)，5 μg/ml亮抑酶肽(Leupeptin)，5 μg/ml 抑肽酶(Aprotinin)，5%甘油］，4 ℃，12 000 g 離心0.5 h，取上清，采用Bradford 方法［13］計算蛋白質含量，分裝并凍于－70 ℃待用。免疫沉淀和激酶凝膠反應步驟參照Ma 等的方法［11］。將得到的X 光片用Quantity One軟件進行量化處理，將對照點設定為1.0，其余各處理點的相對值由處理點的數值除以對照的值。

1.2.7 酶聯免疫法(ELISA)測定CaM 含量 收集過夜培養后的原生質體，加入2 倍體積的預冷提取液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EGTA，0.5 mmol/L PMSF，20 mmol/L NaHSO4，0.15 mol/L NaCl)，渦旋震蕩2 min(可用超聲波破碎);4 ℃12 000 g 離心0.5 h，參照ELISA 試劑盒(TaKaRa 公司產品)方法測定原生質體中CaM 含量，鈣調素含量以μg/mg表示(以蛋白質計)。

1.2.8 H2O2含量的測定 H2O2含量的測定參照張超強等的方法［14］。0.5 g 的玉米葉片，加入預冷的4 ml 三氟乙酸研磨，12 000 g 離心30 min;取0.5 ml上清液，加入等體積10 mmol/L磷酸緩沖液和2 倍體積的1 mol/L KI，在390 nm 處測定吸光值，H2O2含量以ng/g 表示(以鮮質量計)。

1.2.9 抗氧化酶的活性測定 超氧化物歧化酶(SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性測定均參照Zhang 等的方法［5］。

1.2.10 數據分析 每個處理重復5 次，數據統計采用SPSS 軟件，用Ducan’s 法分析差異顯著性。

2 結果

2.1 外源BR 誘導對玉米葉片葉肉細胞原生質體CaM 含量的影響

為了研究外源BR 對玉米葉片原生質體中CaM含量的影響，用10 nmol/L BR 處理分離得到的玉米葉片原生質體，并測定CaM 含量。結果(圖1)表明:與對照相比，外源BR 處理顯著提高了玉米葉片原生質體中CaM 含量，CaM 含量在BR 處理30 min時達最大值，增加了2.8 倍，隨后開始下降，到60 min 時下降到正常水平。

圖1 10 nmol/L 油菜素內酯(BR)處理不同時間后玉米葉片葉肉細胞原生質體鈣調素(CaM)含量的變化Fig.1 Time course of calmodulin(CaM)content in maize mesophyll protoplasts treated with 10 nmol/L brassinosteroids (BR)

2.2 CaM 參與BR 誘導的抗氧化防護

為了確定CaM 是否參與BR 誘導的抗氧化防護過程，玉米植株預先用CaM 拮抗劑處理4 h，再用10 nmol/L BR 處理30 min(水處理為對照)，測定抗氧化防護酶SOD、APX 的活性以及H2O2含量的變化。結果(圖2)顯示CaM 拮抗劑幾乎完全抑制了BR 誘導的玉米葉片中抗氧化防護酶SOD、APX 的活性，這表明CaM 參與了BR 誘導的玉米葉片的抗氧化防護。

2.3 CaM 對BR 誘導的ZmCCaMK 基因表達以及激酶活性、H2O2含量的影響

為研究CaM 和ZmCCaMK 在BR 誘導的抗氧化防護過程中的關系，首先用CaM 拮抗劑W7 和TFP 預處理玉米幼苗，再通過熒光定量PCR 技術測定玉米葉片中ZmCCaMK 基因表達量，同時用凝膠激酶反應測定ZmCCaMK 的激酶活性。結果表明:CaM 抑制劑的預處理能顯著降低BR 誘導的ZmCCaMK 基因表達和激酶活性增加，而W7 和TFP 本身對其沒有影響(圖3)。此外，CaM 拮抗劑W7 和TFP 預處理也顯著抑制了BR 誘導的H2O2積累。這些結果說明CaM 參與BR 誘導的ZmCCaMK 活化及H2O2積累。

圖2 CaM 拮抗劑TFP 和W7 預處理對BR 誘導的抗氧化防護酶SOD 和APX 的影響Fig.2 Effects of pretreatment with CaM antagonists of TFP and W7 on BR-induced antioxidant enzymes SOD and APX

圖3 鈣調素拮抗劑預處理對BR 誘導的玉米葉片中ZmCCaMK 基因表達和激酶活性、H2O2含量的影響Fig.3 The effects of pretreatment with CaM antagonists on ZmCCaMK expression and the activities of ZmCCaMK，and the content of H2 O2

2.4 瞬時表達和瞬時沉默ZmCCaMK 基因對BR誘導的原生質體中CaM 含量的影響

采用原生質體瞬時表達及瞬時沉默體系，瞬時表達及瞬時沉默ZmCCaMK 基因，并經BR 處理30 min，以轉化空載為對照，然后用酶聯免疫法測定樣品中CaM 含量。結果(圖4)表明:瞬時表達ZmCCaMK 基因后，CaM 含量明顯增加，并且BR 處理后仍有部分增加;瞬時沉默ZmCCaMK 基因后，CaM 含量明顯減少，且BR 處理也僅有略微增加。說明ZmCCaMK 也參與調節玉米葉片中BR 誘導的CaM含量。

3 討論

植物在整個生長發育過程中會受到各種不良環境的影響，如鹽脅迫、干旱脅迫等，這些非生物脅迫主要是干擾植物細胞中活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產生和清除之間的平衡，從而導致植物細胞遭受氧化脅迫。在正常條件下，ROS 的生成和清除處在一定的平衡狀態，不會對細胞造成損傷，但當處于環境脅迫時，植物體內ROS 急劇積累而使細胞受到氧化脅迫［15］。然而植物在長期的進化中為了生存，在受到環境脅迫時，可以通過改變細胞代謝及誘導多種防御機制來響應環境脅迫［16］。越來越多的研究結果表明，植物激素BR 在這一過程中起著十分重要的作用。Zhang 等［5］的研究結果表明BR 能誘導超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等抗氧化防護酶活性上調，提高清除ROS 的能力，從而緩解干旱脅迫對植物造成的氧化損傷。Liu 等［17］的研究結果表明BR 可以誘導抗氧化防護酶活性上調，從而減輕低溫對高山離子芥造成的氧化損傷。但對BR 誘導的抗氧化防護機理的研究報道較少。本研究發現，BR 可以顯著提高玉米葉片葉肉細胞原生質體的CaM 含量，同時CaM 拮抗劑試驗結果表明，CaM 參與了BR 誘導的抗氧化防護酶活性的提高以及H2O2的積累。這表明BR誘導的CaM 影響H2O2的積累，進而提高了抗氧化防護酶SOD 和APX 活性。

圖4 瞬時表達及瞬時沉默ZmCCaMK 對BR 誘導的原生質體CaM 含量的影響Fig.4 The content of CaM exposed to BR treatment in the protoplasts transiently expressing or transiently silencing ZmCCaMK

CaM 和ZmCCaMK 都參與BR 誘導的抗氧化防護過程。為研究在BR 信號通路中它們之間的相互關系，本研究首先進行了抑制劑試驗，結果表明CaM 參與BR 誘導的ZmCCaMK 活化。為進一步研究CaM 和ZmCCaMK 在BR 信號轉導中的關系，我們借助玉米原生質體瞬時表達及瞬時沉默體系瞬時表達及瞬時沉默ZmCCaMK 基因，發現ZmCCaMK也參與并調控玉米葉片中BR 誘導下CaM 的含量變化。這表明BR 可以誘導CaM，進而激活ZmCCaMK，同時ZmCCaMK 也可以反過來影響BR 誘導的CaM 含量。近年來越來越多的研究結果表明，CaM 和H2O2等信號分子之間存在一個交叉對話機制［10，18］，因此推測CaM 和ZmCCaMK 在BR 誘導的抗氧化防護過程中可能存在這一個交叉對話機制。

綜上所述，CaM 在BR 誘導的抗氧化防護過程中具有重要的作用，并且CaM 和ZmCCaMK 之間存在一個交叉對話機制，這對于深入研究BR 調控植物的抗逆應答反應機制提供了理論依據。

［1］ 阮英慧，董守坤，劉麗君，等. 干旱脅迫下油菜素內酯對大豆花期生理特性的影響［J］.作物雜志，2011，6:33-37.

［2］ 曹云英，趙 華. 高溫脅迫下油菜素內酯對水稻幼苗的保護作用［J］.中國水稻科學，2007，21(5):525-529.

［3］ 張林青. 油菜素內酯對鹽脅迫下番茄幼苗生理指標的影響［J］. 北方園藝，2013 (1):1-3.

［4］ ZHU Y，ZUO M X，LIANG Y L，et al. MAP65-1a positively regulates H2O2amplification and enhances brassinosteroid-induced antioxidant defence in maize［J］. Journal of Experimental Botany，2013，64(12):3787-3802.

［5］ ZHANG A Y，ZHANG J，YE N H，et al. ZmMPK5 is required for the NADPH oxidase-mediated self-propagation of apoplastic H2O2in brassinosteroid-induced antioxidant defence in leaves of maize［J］. Journal of Experimental Botany，2010，61(15):4399-4411.

［6］ XIA X J，WANG Y J，ZHOU Y H，et al. Reactive oxygen species are involved in brassinosteroid-induced stress tolerance in cucumber［J］. Plant Physiology，2009，150(2):801-814.

［7］ 張云霞，石 勇，王瑞剛，等. 初始鹽脅迫下ABA 與CaM 對胡楊葉片氣體交換的調控［J］. 林業科學，2008，44(1):57-64.

［8］ 谷俊濤，郭秀林. 水分脅迫下鈣，鈣調素對小麥幼苗生長及過氧化物酶同工酶的影響［J］. 華北農學報，2001，16(3):62-67.

［9］ DESIKAN R，SOHEILA A H，HANCOCK J T，et al. Regulation of the arabidopsis transcriptome by oxidative stress ［J］. Plant Physiology，2001，127(1):159-172.

［10］ HU X L，JIANG M Y，ZHANG J H，et al. Calcium–calmodulin is required for abscisic acid-induced antioxidant defense and functions both upstream and downstream of H2O2production in leaves of maize (Zea mays)plants［J］. New Phytologist，2007，173(1):27-38.

［11］ MA F F，LU R，LIU H Y，et al. Nitric oxide-activated calcium/calmodulin-dependent protein kinase regulates the abscisic acid-induced antioxidant defence in maize［J］. Journal of Experimental Botany，2012，63(13):4835-4847.

［12］ DING Y F，CAO J M，NI L，et al. ZmCPK11 is involved in abscisic acid-induced antioxidant defence and functions upstream of ZmMPK5 in abscisic acid signalling in maize［J］. Journal of Experimental Botany，2013，64(4):871-884.

［13］ BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］. Analytical Biochemistry，1976，72(1):248-254.

［14］ 張超強，楊穎麗，王 萊，等. 鹽脅迫對小麥幼苗葉片H2O2產生和抗氧化酶活性的影響［J］. 西北師范大學學報:自然科學版，2007，43(1):71-75.

［15］ FRYER M J，ANDREWS J R，OXBOROUGH K，et al. Relationship between CO2assimilation，photosynthetic electron transport，and active O2metabolism in leaves of maize in the field during periods of low temperature［J］. Plant Physiology，1998，116(2):571-580.

［16］ BOHNERT H J，JENSEN R G. Strategies for engineering waterstress tolerance in plants［J］. Trends in Biotechnology，1996，14(3):89-97.

［17］ LIU Y J，ZHAO Z G，SI J，et al. Brassinosteroids alleviate chilling-induced oxidative damage by enhancing antioxidant defense system in suspension cultured cells of Chorispora bungeana［J］.Plant Growth Regulation，2009，59(3):207-214.

［18］ HU X L，WANG W，LI C Q，et al. Cross-talks between Ca2+/CaM and H2O2 in abscisic acid-induced antioxidant defense in leaves of maize plants exposed to water stress［J］. Plant Growth Regulation，2008，55(3):183-198.