長期免耕及常規耕作對土壤胡敏酸含量及其結構的影響

范如芹， 羅 佳， 嚴少華， 楊學明， 張振華

(1.江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所，江蘇 南京210014;2.加拿大農業與農業食品部溫室與加工作物研究中心，安大略N0R 1G0)

土壤有機碳(Soil organic carbon，SOC)對土壤性質和一系列土壤過程至關重要［1-3］，增加其含量不僅有助于維持土壤養分和農業可持續發展，而且有利于降低土壤CO2排放，減緩溫室效應［4］。在當今全球氣候變化的大背景下，國際社會對農業土壤固定大氣CO2日益關注，近年來關于農業土壤有機碳含量及穩定性的研究報道日漸增多，其中不同耕作方式下農田土壤作為碳“源”或碳“匯”的問題是關注的焦點。傳統耕作(Conventional tillage，CT)方式下頻繁的土壤擾動可致使土壤有機碳礦化或因土壤侵蝕而流失，最終導致農田土壤成為大氣CO2的“源”［5］。20 世紀60 年代以來，保護性耕作因具有降低生產投入、保持水土、增加土壤肥力等優勢而在世界許多地區陸續實施［6］。免耕(No tillage，NT)作為保護性耕作的極端形式，在CO2等溫室氣體含量不斷上升的背景下更是備受關注。研究結果表明，保護性耕作能夠促進土壤有機碳固定，將CT 轉變為NT 是增加農業土壤有機碳的有效措施之一［7-8］。West 和Marland［9］對美國能源部的數據進行分析后指出，傳統耕作轉變為免耕后，美國的土壤固碳速率約為300 kg/(hm2·a)，C。Kern 和Johnson［10］指出，雖然由常規耕作轉變為免耕并不能固定足夠多的碳來抵消工業燃料燃燒釋放的碳量，但NT 的廣泛應用將對緩解全球氣候變化起到非常重要的作用。然而，也有大量研究發現，NT 和CT 相比，并不能增加土壤有機碳固定［11-12］。NT 對土壤有機碳的影響機制復雜，其結果會隨耕作年限、土壤質地、氣候條件等因子而變化。

另一方面，土壤有機碳的固定不僅包括其含量的增加，土壤有機碳質量或穩定性是至關重要的評價指標。活性的土壤有機碳組分在土壤中穩定性差、易礦化，且所占比例極低;腐殖質則是土壤有機碳的最大組成部分，它的形成與轉化對土壤肥力、土壤固碳和環境解毒均有重要意義。其中，胡敏酸(Humic acid，HA)又是腐殖質中最活躍的組分，對土壤結構形成和土壤有機碳含量變化起重要作用［13］。國內外學者大多針對不同施肥措施下胡敏酸的差異展開研究［14-16］，而對不同耕作管理方式引起的胡敏酸的變化研究還十分有限。呂貽忠等［17］研究發現翻耕、旋耕以及深松等耕作方式下胡敏酸分子結構中各個基團的含量存在差異。目前對長期免耕下胡敏酸的含量和結構特征還了解甚少，僅趙紅等［18］報道了在中國東北黑土上26 年的NT 試驗對黑土胡敏酸含量及結構的影響，而對于由NT 轉變為CT 后胡敏酸的后續變化更是缺乏研究。

中紅外光譜(Mid-infrared spectroscopy，MIRS)技術是通過測量分子對紅外光吸收從而得到分子結構信息的一種檢測方法，是土壤有機質特征分析的一個重要工具。核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)技術也是有機化合物結構研究中的重要研究手段，用MIRS 研究腐殖質含氧功能團特性優于NMR 光譜，而研究腐殖質結構則往往需要借助NMR 技術［19］。目前國際上利用MIRS進行農業土壤有機質性質如土壤有機碳結構穩定性的研究是土壤學領域的熱點，在中國正處于剛剛起步且逐漸升溫階段。分析有機質結構穩定性最常應用于土壤腐殖質結構特性的研究。González-Pérez 等［20］利用NMR 和MIRS 技術分析了灰化土剖面的胡敏酸的結構特征，發現隨著土層深度的增加，烷基碳含量增加，而醛基碳、芳香碳和酚碳含量降低，說明微生物生物量的亞甲基逐漸富集。顧志忙等［21］對黑土、紅壤、黃棕壤等不同土壤類型中腐殖酸進行了MIRS 分析，綜合比較了胡敏酸含量和腐殖化程度的差異。

本研究旨在綜合利用MINS 和NMR 技術研究土壤HA 含量及結構對耕作方式改變的響應，分析長期免耕對土壤有機碳穩定性的影響，揭示農業管理措施轉變引起的土壤有機碳的變化機制，為客觀評判保護性耕作和促進土壤有機碳固定提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究區域與樣品采集

長期耕作定位試驗小區位于加拿大安大略省西南部的加拿大農業部Eugene Whelan 實驗站，土壤類型為Brookston 壤質粘土，表層15 cm 土壤砂粒、粉粒和粘粒所占百分比含量分別為28%、35%和37%(美國制)，土壤pH 值介于6.1 ～6.5。因為表層土壤坡度小于1°，所以土壤侵蝕和表層土壤淋失在研究區可以忽略。耕作試驗始于1983 年秋，每個小區長35 m 寬12 m。耕作方式有免耕(NT83)和傳統耕作(CT83)，為研究耕作方式改變對土壤的影響，從1997 年起部分免耕小區改回傳統耕作(CT97)，部分傳統耕作小區改為免耕(NT97)。種植方式為玉米連作和玉米-大豆輪作。土壤樣品于2012 年秋采集于玉米-大豆輪作的玉米種植小區。采樣深度為土壤表層10 cm，每個耕作處理4 個重復。

1.2 胡敏酸(HA)提取與分析

1.2.1 胡敏酸提取純化 將風干后的土壤樣品除去肉眼可見礫石等雜質，取500 g 用蒸餾水除去水溶物和水浮物，用0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L Na2P2O7混合液(pH=13)提取1 h，3 500 r/min離心15 min，反復提取3 次。向上述提取液中加入0.5 mol/L H2SO4調節pH 為1.0 ～1.5，沉淀即為胡敏酸。將分離得到的胡敏酸粗組分用HCl (1∶ 1)調到pH=7.0，高速離心(8 000 r/min，20 min)去除粘粒，反復溶解-沉淀2 次。然后將其放入半透膜中透析，2 ～3 h 換一次水，用AgNO3檢測至出現少量白色沉淀。再轉入電滲析儀中電滲析，至電流很小并陰極室無酚酞反應為止。將純化完的樣品進行旋轉蒸發(50 ～60 ℃)至體積很小，轉入50 ml 塑料小燒杯中，用冷凍干燥機進行冷凍干燥。

1.2.2 胡敏酸結構特征分析 對提純的土壤胡敏酸組分進行中紅外光譜和固體13C-NMR 核磁共振測試。紅外光譜儀器為傅立葉轉換紅外光譜儀(Bruker Optik GmbH，Ettlingen，Germany)。將樣品研磨至小于53 μm，裝入進樣器并輕輕將表面壓平，每個樣品壓至相同程度。測定空白為KBr 壓片，利用儀器HTX 探測器測得樣品的MIR 光譜。掃描64 次，分辨率為2 cm-1，掃描波數范圍為500 ～4 000 cm-1。固體13C-NMR 光譜測定儀器為德國Bruker公司生產的AV 400 固體13C -NMR 波普儀，采用交叉極化-魔角旋轉(CP-MAS)技術，13C 的共振頻率為100.57 MHz，魔角自旋頻率為5 KHz，樣品的接觸時間為2ms，循環時間為5 s，數據點為2 048，參考標準為δDSS=0。

1.3 數據處理

采用SAS 9. 0 (SAS Institute，Cary，NC)軟件LSD 顯著性差異檢驗進行均值比較和分析，用皮爾森(Pearson)相關系數進行相關性分析，采用Sigma-Plot 12.0 (Systat Software，Inc.，Chicago，IL，USA)軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 長期免耕及常規耕作下胡敏酸碳(HA-C)和胡敏酸氮(HA-N)含量

由表1 可以看出，4 種耕作處理對胡敏酸含量以及胡敏酸中碳、氮的含量均產生了不同影響。其中胡敏酸含量在CT83 處理的土壤中為11.1 g/kg，顯著高于NT97 處理、NT83 處理和CT97 處理(P ＜0.05)，NT97 處理與CT97 處理沒有顯著差異，而NT83 處理的胡敏酸碳含量則顯著低于其他3 種耕作處理，比CT83 處理低23.3%，可見長期免耕不利于胡敏酸的形成。不同耕作方式下土壤中胡敏酸碳含量與胡敏酸含量差異呈現類似趨勢，即HA-C 含量CT83 處理最高而NT83 處理最低，不同的是，NT83 處理的土壤中HA-C 含量和NT97 沒有顯著性差異(P ＞0.05);與CT83 處理相比，CT97 處理對HA-N 以及對胡敏酸中C 和N 百分含量均沒有產生明顯影響(P ＞0.05)，但顯著增加了胡敏酸及胡敏酸碳含量;而與NT83 處理相比，CT97 處理的土壤胡敏酸及其碳含量均顯著提高(P ＜0.05)。這與Martins 等［22］的研究結果一致。究其原因，一方面，免耕下每年大量秸稈還田，植物殘體歸還數量高于其代謝變化容量，可導致有機物質的強新陳代謝［23］，從而使有機質形成的脂肪化合物含量較高，半醌類自由基含量低，芳香碳含量低［24］。傳統耕作與之相反，作物秸稈收獲導致輸入土壤的新鮮物料減少，從而使得土壤的腐殖化程度較高;傳統耕作下頻繁的土壤擾動加劇了活性有機碳的分解礦化［25］，也是造成其土壤腐殖化程度較高的重要原因之一。

表1 不同耕作方式下土壤胡敏酸及其碳、氮素含量Table 1 Content of humic acid and its carbon and nitrogen concentrations in soils under different tillage managements in southwestern Ontario，Canada

2.2 長期免耕及常規耕作下胡敏酸結構穩定性特征

從圖1 可知，不同耕作處理下土壤胡敏酸在3 300 cm-1(N-H 和O-H 伸縮振動)、2 930 cm-1(＞CH2和-CH3基團中C-H 鍵反對稱伸縮振動)、2 610 cm-1(羧基的C-O 對稱伸縮振動)、1 725 cm-1(＞C=O 的伸縮振動)、1 270 cm-1(羧基中C-O 伸縮和O-H變形振動及醚類芳基伸縮振動)以及830 cm-1(芳香C-H 平面彎曲振動)處的吸收峰明顯［26-28］，說明各耕作處理下土壤胡敏酸基本結構較為一致。3 000 ～3 600 cm-1處的寬吸收帶面積表現為CT83與CT97 明顯大于NT97 與NT83，說明前者的聚合-OH含量高于后者［29］。2 610 cm-1、1 725 cm-1、1 270 cm-1以及830 cm-1處吸收帶也表現為隨耕作強度增加，吸收強度增加的趨勢(CT83 ＞CT97 ＞NT97 ＞NT83)，可見胡敏酸氧化程度和芳香度隨耕作擾動強度的增加而增加，長期免耕使土壤胡敏酸氧化度和芳香度趨于降低。呂貽忠等［17］通過黑土胡敏酸的紅外光譜分析結果表明，翻耕處理下黑土胡敏酸的芳香化程度高于保護性耕作，且保護性耕作下胡敏酸的脂肪性支鏈增加可改變腐殖酸親水性能，并指出土壤腐殖質結構的演變將對土壤肥力產生重要影響，有必要利用其他光譜手段更深入地揭示不同耕作措施對土壤腐殖質結構的影響。

因此，為了更為精確地研究不同耕作方式對胡敏酸結構特征的影響，我們借助13C-NMR 方法對其各官能團吸收強度進行了分析(圖2)。不同耕作處理下土壤胡敏酸的核磁共振譜圖可分為烷基碳(δ0-45)、甲氧基碳(δ45-65)、烷氧碳(δ65-90)、乙縮醛基碳(δ90-110)、芳香碳(δ110-145)、酚氧碳(δ145-160)和羧基碳(δ160-185)7 個共振區域，其中乙縮醛基碳(δ90-110)和酚氧碳(δ145-160)的共振信號相對不明顯。

圖1 不同耕作方式下土壤胡敏酸中紅外光譜Fig.1 MIR spectra of humic acid in soils under different tillage managements

圖2 長期免耕和常規耕作下土壤胡敏酸的13C-NMR 譜圖Fig.2 13C-NMR spectra of HA in soils under long-term no tillage and conventional tillage

進一步對各區域出現的位移信號進行計算(表2)可知，NT97 處理和NT83 處理的土壤胡敏酸不同有機功能團的相對含量大小為:烷基碳、甲氧基碳和烷氧基碳含量明顯高于乙縮醛基碳、芳香碳、酚氧碳和羧基碳。NT83 處理的烷基碳和甲氧基碳含量顯著高于CT97 處理和CT83 處理，其芳香碳和酚氧碳的含量則顯著低于CT97 處理和CT83 處理(P ＜0. 05)。NT83處理與NT97 處理土壤胡敏酸在烷基碳、羧基碳和乙縮醛基碳含量中表現出明顯差異。與NT83 相比，CT97 處理的土壤胡敏酸中除烷氧基碳外，其他官能團含量均發生了顯著變化，脂肪族碳含量大幅度降低而芳香碳比例顯著增加。本研究結果不同于申艷［30］在中國東北黑土上的研究結果，其原因可能是其所研究的土壤為短期免耕，耕作方式對胡敏酸結構造成的影響還沒有開始顯現。NT83、NT97、CT97 和CT83 下胡敏酸芳香度分別為32. 1%、36. 0%、46.1%和46.8%，即長期免耕下胡敏酸芳香度顯著低于長期傳統耕作，而脂化度則相反。這說明耕作擾動加速了土壤腐殖質的縮合和氧化，使土壤胡敏酸老化，結構變得復雜，脂族性下降，芳香性增加，這與孫本華等［31］的研究結論一致。

表2 長期免耕和常規耕作下土壤胡敏酸不同官能團碳的相對含量Table 2 Relative contents of carbon functional groups of HA in soils under long-term no tillage and conventional tillage

NT83 中微生物分解后的產物(烷基碳和羧基碳)占37.2%，木質素(芳香碳、酚基碳)占18.4%，碳水化合物(包括甲氧基碳、烷氧碳和乙縮醛基碳)占44.4%，可見土壤胡敏酸是以碳水化合物結構為核心形成的。NT83、NT97、CT97 和CT83 處理下胡敏酸微生物分解產物含量分別為37.2%、22.9%、21.0 和20.9%，表明長期免耕下微生物分解后的產物顯著高于傳統耕作，且隨耕作強度增加其含量逐漸降低，這說明長期免耕下微生物活動明顯比傳統耕作活躍，耕作擾動降低了微生物的活性。NT83、NT97、CT97 和CT83 下胡敏酸木質素含量所占的比例分別為18.4%、26.4%、31.6%和36.9%，可見隨著耕作強度的增加，微生物分解產物有向木質素轉化的趨勢。

3 結論

耕作年限與耕作方式對土壤中胡敏酸及胡敏酸碳產生重要影響。隨著耕作強度或耕作年限的增加，土壤中胡敏酸及胡敏酸碳也增加，與NT83 相比，NT97 土壤胡敏酸含量顯著提高。與免耕相比，傳統耕作促進了土壤腐殖化程度的提高。胡敏酸氧化程度和芳香度亦隨耕作擾動強度的增加而增加，長期免耕使土壤胡敏酸氧化度和芳香度趨于降低，免耕轉變為傳統耕作后，胡敏酸氧化度和芳香度開始增加。土壤胡敏酸烷基碳和羧基碳含量隨免耕年限增長而增加。長期免耕下微生物分解后的產物顯著高于傳統耕作。以上結果說明，耕作擾動提高了土壤的腐殖化程度，加速了土壤胡敏酸的縮合和氧化，使土壤胡敏酸老化，結構趨于復雜，而免耕則有助于提高土壤微生物活性，并使土壤胡敏酸脂族性提高。

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