輻射花粉授粉技術誘導黃瓜單倍體

蘇 芃， Nguyen Hac Hien， 管 葦， 崔 利， 陳勁楓

(南京農業大學園藝學院，作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，江蘇 南京210095)

黃瓜(Cucumis sativus L.)屬于葫蘆科黃瓜屬，是一種重要的世界性蔬菜作物［1-4］。黃瓜遺傳基礎狹窄，種內變異率僅為3% ～8%，加上長期的定向選擇和大量雜種F1代的廣泛應用，使得多數地方品種資源趨于絕跡，導致現代黃瓜育種面臨著資源危機［5-7］。目前簡單的常規育種手段已不能滿足黃瓜新品種的選育及抗病育種的需求，單倍體培養被育種家認為是縮短育種周期、提高選擇效率、獲得遺傳材料和有用突變體的一個重要途徑［8］。通過單倍體誘導技術可以快速獲得純系(單倍體和雙單倍體)，進而可以加快黃瓜的育種進程。

輻射花粉授粉結合胚拯救技術是一種獲得黃瓜單倍體的重要手段，Sauton［9］首次采用輻射花粉授粉結合胚拯救技術獲得甜瓜單倍體。在黃瓜上，也有研究報道通過輻射花粉誘導單倍體成功。

本試驗系統的研究了輻射劑量、花粉供體基因型、母本基因型對誘導黃瓜單倍體植株再生率的影響，旨在摸索出一套高效的輻射花粉授粉誘導黃瓜單倍體的技術體系，為黃瓜種質創新提供一個可靠的技術平臺。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗所用黃瓜材料來源于南京農業大學園藝學院。母本基因型:南抗1 號(F1)、津綠(F1)、博美(F1)、EC1(自交系)、5211(自交系)、CC3(自交系)、11535F(Poinsett97 ×CC3 G)、11514F(PO2 G×Beit Anpha)、11536F(Poinsett97 × PO2 G)、11568(EC1 ×津綠G)、12211S(長春密刺×10406S-93)、12331S(NC-76 × 二早子)、12523S(PO2 × 平望黃瓜)、12524S(PO2 ×SWCC8)、12548S(PO2 ×Marketmore 2000(401))、12549S(PO2 ×7011A)、12551S(PO2 × Poinset 97)、12552S(PO2 × L8)、12553S(PO2 × 白 玉)、12361S (PO2 G × Poinsett 97)、12359S(627 G ×P01)。試驗地點在南京農業大學江浦實驗基地，花粉供體基因型:5211(自交系)、CC3(自交系)和南抗一號(F1)。

輻射源:江蘇省農業科學院輻射中心60Coγ 源。輻射劑量為:150 Gy、250 Gy、350 Gy，劑量率為2.62 Gy/min。基本培養基:MS 培養基+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉，pH 值為5.8。繼代培養基:MS 培養基+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉+0.2 mg/L 6-BA，pH 值為5.8。生根培養基:1/2MS 培養基+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉+0.2m g/L 6-BA，pH 值為5.8。

1.2 方法

1.2.1 花粉輻射與授粉 在開花前1 d 采集黃瓜花粉供體材料的雄花，裝入防水袋，在江蘇省農業科學院進行60 Coγ 射線輻射(輻射劑量梯度為150 Gy、250 Gy、350 Gy)處理后，將雄花放在鋪有濕潤濾紙的培養皿中常溫保存。當天下午選擇第2 d 開花的雌花進行夾花隔離。第2 d上午用輻射過的雄花進行授粉，每3 朵雄花授1朵雌花，授粉后的雌花套袋隔離至坐果。第1 d采集5211 的雄花進行150 Gy 輻射劑量輻射，第2 d 用輻射處理過的雄花對當天開花的雌花做授粉處理。

1.2.2 胚胎拯救及幼苗培養 授粉2 ～3 周后采收果實，在超凈工作臺上，用75%的乙醇對果實表面消毒，將果實刨開分離種子接種到不添加任何激素的MS 固體培養基上進行胚拯救培養，待胚長至肉眼可見時剝去種皮進一步培養。隨后，對部分黃綠色的小胚接種于繼代培養基上直接成苗培養。

1.2.3 馴化移栽 當胚長成小植株后將其轉接至生根培養基上，生根培養12 d 后，將再生植株煉苗3 d后移栽到營養缽中。

1.2.4 再生植株倍性鑒定 待植株長成后，進行染色體計數［10］，確認植株倍性。

1.2.5 數據統計分析 統計不同基因型和不同輻射劑量下黃瓜植株再生誘導率。植株再生率=植株再生數/種子數×100%單倍體再生率=單倍體植株數/種子數×100%二倍體再生率=二倍體植株數/種子數×100%

2 結果與分析

2.1 花粉供體基因型對單倍體誘導率的影響

2.1.1 花粉供體基因型對植株再生率影響 花粉經150 Gy 劑量下輻射處理時，花粉供體為5211 時植株再生率最高，為3.92%，顯著高于 CC3(0.42%)及南抗一號(0.32%)作為花粉供體時的再生率，表明花粉供體基因型對植株再生率有影響;在輻射劑量250 Gy 輻射處理花粉時，基因型對植株再生率也有影響;但是在使用350 Gy 輻射劑量輻射處理花粉時，植株再生率都較低(表1)。

2.1.2 花粉供體基因型對單倍體誘導率影響 不同花粉供體基因型對單倍體植株誘導率的影響顯著(P ＜0.05)。5211 經150 Gy 劑量輻射處理的單倍體植株誘導率最高，為1.96%，顯著高于150 Gy 劑量處理下CC3(0.21%)及南抗一號(0.19%)的單倍體植株誘導率，南抗一號單倍體植株誘導率最低。5211 經250 Gy 劑量輻射處理誘導單倍體植株再生率也最高(1.64%)，而CC3 在250 Gy 劑量處理下單倍體植株誘導率最低(0.11%)。以上研究結果都不同于G. Caglar、Ficcadenti［11-12］，他們的研究結果表明相同輻射劑量處理條件下花粉供體的基因型對單倍體誘導率沒有影響。

表1 不同花粉供體基因型及輻射劑量對植株再生率的影響Table 1 Effect of different genotypes and gamma ray doses on the rate of plants regeneration

2.1.3 花粉供體基因型對二倍體再生率影響 經150 Gy 輻射處理后再生后代中仍有二倍體出現，其比例為5211(1.96%)＞CC3(0.21%)＞南抗一號(0.13%)。

以上結果表明150 Gy 輻射劑量條件下植株再生率和單倍體再生率5211 ＞CC3 ＞南抗一號，說明使用5211 作為花粉供體輻射后授粉誘導較易獲得單倍體，而南抗一號較難作為花粉供體用于獲得單倍體。此外隨著植株再生率的增加，單倍體植株再生率也增加。

2.2 輻射劑量對植株再生率的影響

對相同基因型不同輻射劑量處理誘導的植株再生率比較分析，結果表明，150 Gy 輻射劑量處理下總體上植株再生率高于250 Gy 及350 Gy 輻射劑量處理下的植株再生率。

2.3 母本基因型對單倍體誘導率的影響

從表2 看出，供體花粉輻射劑量為150 Gy、花粉供體基因型為5211 時，不同母本基因型單倍體的誘導率存在很大差異，其中6 個基因型沒有誘導出再生植株，占基因型總量的60%，其他基因型單倍體誘導率為0.26 ～0.54。

3 討論

在甜瓜中不同正反交組合單倍體植株的再生率有顯著差異［12］;黃瓜上，有研究結果表明親本的基因型對單倍體再生率沒有影響［13］。本研究發現，親本基因型對植株再生率影響顯著。本試驗發現150 Gy 輻射劑量下，不同花粉供體植株再生率為5211 ＞CC3 ＞南抗一號，說明5211 作為輻射花粉供體誘導較易獲得單倍體，而南抗一號作為花粉供體較難獲得單倍體。由于試驗場地有限，所以每株留瓜3 ～4個，比常規多留1 ～2 個種瓜，且越晚授粉的種瓜由于營養缺乏導致發育良好的種子數較少，從而導致單倍體再生率較低，本研究得到的單倍體植株再生率最高為1.96%。

表2 母本基因型對單倍體誘導率的影響Table 2 The effects of genotype on haploid induction efficiency

本試驗對10 個母本基因型黃瓜誘導研究中，6個基因型沒有誘導出再生植株，占基因型總量的60%;4 個基因型誘導出再生植株，占基因型總量的40%，單倍體誘導率為0.26 ～0.54，說明不同母本基因型單倍體的誘導率存在較大的差異。

研究認為60Coγ 射線輻射花粉授粉是誘導葫蘆科作物產生單倍體的有效輻射源［13］。輻射劑量的選擇是誘導產生單倍體的關鍵因素之一。有研究結果表明，合適的輻射劑量選擇和植物的倍性及花粉粒的大小有關，倍性越高或花粉粒越小越耐輻射［14-15］。黃瓜、西瓜常用的推薦輻射劑量為200 ～300 Gy［11，16］。但 是Ficcadenti［12］在 黃 瓜 上 采 用100 ～300 Gy 劑量，結果表明150 Gy 單倍體再生率最高。本研究結果也證實了150 Gy 為最佳輻射劑量。

［1］ 吳傳萬，杜小鳳，顧大路，等. 植物源藥肥對溫室黃瓜生長發育和土壤環境的影響［J］. 江蘇農業學報，2014，30(1):92-99.

［2］ 張黎杰，周玲玲，李志強，等.菌渣復合基質栽培對目光溫室黃瓜生長發育和產量品質的影響［J］. 江蘇農業科學，2014，42(3):109-111.

［3］ 費雨蘭，王 晶，沈 佳，等.不同砧木嫁接對黃瓜長勢及果實品質的影響［J］.江蘇農業科學，2013，41(12):147-149.

［4］ 劉 琴，王 艷，徐 健，等. 枯草芽孢桿菌Bs-1013 的抑菌活性及其包衣對黃瓜發芽生長的影響［J］. 江蘇農業科學，2013，41(11):117-119.

［5］ KENNARD W C，POTTER K，DIJKHUIZEN A，et al. Linkages among RFLP，RAPD，isozyme，disease resistance，and morphological markers in narrow and wide crosses of cucurnber［J］. Theoretical and Applied Genetics，1994，89:42-48.

［6］ BRADENN J M，STAUB J E，WYE C，et al. Towards an expanded and integrated linkage map of cucumber (Cucumis sativus L.)［J］.Genome，2001，44:111-119.

［7］ 李加旺，張文珠，何忠魁. 黃瓜資源篩選與育種研究及其發展趨勢［J］. 天津農業科學，1999，5(4):36-38.

［8］ 張獻龍. 植物生物技術［M］. 北京:科學出版社，2004:35-69.

［9］ SAUTON. A，DUMAS DE VAULX R. Obtention de plantes hapl?ids chezle melon (Cucumis melon L.)aprèsgynogènèse induite pardu pollen irradiè［J］. Agronomie，1987，7:141-148.

［10］ 陳勁楓，錢春桃.利用幾種園藝作物卷須制片鑒定染色體數目的研究［J］. 園藝學報，2002，29(4):378-380.

［11］ CAGLAR. G，ABAK K. Progress in the production of haploid embryos，plants and doubled haploids in cucumber (Cucumis sativus L.)by gamma irradiated pollen in Turkey［J］. Acta Horticulturae，1999，492:317-320.

［12］ FICCADENTI N，VERONESEP，SESTILIS，et al. Influece of genotype on the inductuin of haploidy in Cucumis melo L. by using irradiated pollen［J］.J Genet＆Breed，1995，49:359-364.

［13］ FARIS N M. The effectof gamma irradiation dose on cucumber(Cucumis sativus L.)haploid embryo production［J］. Acta Physiologiae Plantarum，1999，21(4):391-396.

［14］ VISSER T，OSST E H. Pollen and pollination experminentsIII the viability of apple and pear pollen as affected by irradiation and storage［J］. Euphytuca，1981. 30:65-70.

［15］ DENISSEN，CJM DENIJS A P M. Effects of gamma irradiation on in vitro pollen germination of different Cucumis species［J］. Euphytica，1987，36:651-658.

［16］ SARI N AK. Induction of parthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated pollen in watermelon［J］. Hortscience，1994，29(10):1189-1190.