兩個紅梨品種花色苷合成相關基因及轉錄因子MYB10 表達模式分析

田 鵬， 蘇艷麗， 康保珊， 魏聞東

(中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南 鄭州450009)

紅色梨品種因屬種差異而表現出不同的著色模式。其中，西洋梨紅星(Pyrus communis CV.Starkrimson)和東方砂梨(P. pyrifolia)雜交種滿天紅［1］即是如此。紅星果實在整個發育期都保持全紅色，滿天紅幼果為綠色，后期經光照果實陽面著紅色。可見，2 個品種最突出的差異在于著色的時間不同。梨果皮顏色主要由花色苷的組成和含量決定［2］。花色苷是類黃酮代謝的終產物之一，其生物合成途徑已基本明確［3］。其中涉及多個參與編碼花色苷合成酶蛋白的基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT，這些基因的表達與花色苷的積累密切相關［3］。因此，研究不同著色模式的紅色梨果皮花色苷合成相關基因表達及轉錄調控有利于揭示紅色梨的著色形成機制，進而為紅色梨新品種選育和改良提供理論依據。目前，參與花色苷合成的結構基因在梨屬植物中已經得以分離克隆［4］，并研究了這些基因在紅巴梨(Max Red Bartlett)和巴梨(Williams)［5］、滿天紅和奧冠紅梨［6］、早白蜜和云紅1 號［7］、紅星和滿天紅［8］中的表達特性，普遍認為，紅色梨品種果皮花色苷的積累由各結構基因協同控制。在花色苷合成調控因子方面，編碼轉錄因子MYB10 的基因已在紅色梨中分離克隆［9］，研究證實，它的表達水平與結構基因的轉錄以及花色苷積累密切相關［5-6］。然而，前人的研究多在西洋梨或砂梨單屬種內進行，種間比較尤其是著色模式存在顯著差異的品種間比較幾乎很少涉及。紅色砂梨的研究多集中于套摘袋條件下，光照對花色苷合成基因表達變化的影響［6-7］，而果實在自然條件下的不同發育階段各基因的轉錄特性尚未見報道。鑒于此，本試驗著重研究西洋梨紅星和東方砂梨雜交種滿天紅兩種不同著色模式品種的果皮在果實的不同發育階段，參與編碼花色苷合成的酶蛋白基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT 以及轉錄因子MYB10 編碼基因的轉錄特性。通過比較，以期得出不同類型的紅色梨品種隨著果實發育和著色變化，及相關基因在轉錄水平上的差異，并探討轉錄因子MYB10 對結構基因表達和果皮花色苷含量累積的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

紅星梨(P. communis cv. Starkrimson)系中國農業科學院鄭州果樹研究所1988 年由新西蘭引入國內的優秀的全紅色西洋梨品種;滿天紅梨(P. pyrifolia CV. Mantianhong)是本所于1989 年選用日本幸水梨(Kosui)為母本，云南火把梨為父本人工雜交培育而成紅色梨優良品種［1］。2 個品種成熟期不同，紅星為早熟品種，果實發育期約85 d，滿天紅為晚熟品種，果實發育期約136 d。

2 個梨品種的果實采自本所品種保存圃。在鄭州地區，紅星盛花期4 月10 日，滿天紅4 月5日，每個品種在各發育期的3 個不同階段進行采摘，共6 個處理。2 個品種的采摘時間:紅星為花后25 d(5 月5 日)、58 d(6 月7 日)和78 d(6 月27 日);滿天紅為花后30 d(5 月5 日)、102 d(8 月15 日)和126 d(9 月8 日)。每個處理采30 個樣品果，10 個果為1 次重復，設3 次重復，采后削取果實著色部位最好的果皮(盡量不含果肉)，液氮冷凍，－80 ℃保存。

1.2 果皮花色苷的提取和含量測定

花色苷含量的測定在馬志本等［10］的方法上稍作改進。果皮稱質量后，加入1.0 ml 鹽酸甲醇(1%)提取液置于冰上進行研磨;當果皮呈勻漿狀時，再加入1.0 ml 提取液，在4 ℃的黑暗條件下浸提1 h;然后轉入1.5 ml 的離心管中，10 000 r/m離心5 min。最后取1.0 ml 上清液，稀釋至3 ml 測定D530、D620和D650值。計算花青苷的含量，以μg/g(鮮質量)為單位表示。

1.3 總RNA 提取及反轉錄

樣品果皮總RNA 的提取方法參照李繼剛等［11］的改良熱硼酸法，DNaseⅠ消化后，用RevertAid premium first strand cDNA synthesis kit (Fermentas)按照試劑操作指南進行反轉錄。

1.4 熒光定量分析

利用熒光染料法進行RT-PCR 和熒光定量分析，反應體系采用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas)按照試劑盒操作指南配置。PCR 反應和熒光信號檢測在LightCycler 480(Roche)熒光定量PCR 儀上進行，程序:95 ℃10 min，然后95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個循環。每個樣設置3 個平行，重復2 次試驗，以Actin 為內參 基 因 對 目 的 基 因(PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT 和MYB10)進行相對定量分析，方法參考Pfaffl［12］，引物參照已公布的基因序列設計(表1)。

表1 熒光定量PCR 引物序列［4-6］Table 1 The primer sequence of qRT-PCR［4-6］

1.5 數據分析

用SPSS11.0 和Excel 2003 軟件進行數據統計分析，用Origin 6.1 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 2 個梨品種果實花色苷含量分析

由于遺傳背景不同，2 個品種著色程度存在很大差異。紅星果實全紅，顏色深紫;滿天紅果實陽面著色，色澤鮮紅。在果實發育的整個階段，紅星果皮的花色苷含量均遠遠高于滿天紅。兩個品種在著色模式方面最明顯的區別在于:紅星幼果期時(花后25 d)全面著紅色，肉眼很難區分3 個發育階段果實外觀著色程度;而滿天紅幼果時(花后30 d)為綠色，著色過程存在一個轉色期(花后102 d 左右)，3 個發育階段外觀著色程度變化明顯。測定兩個品種果實3 個發育時期果皮中花色苷含量變化后發現，花色苷含量與果實外觀著色程度相一致。紅星花色苷含量在花后58 d 時最高，變化趨勢為先升高后降低;滿天紅則幼果時幾乎檢測不到花色苷，隨著發育，含量呈逐漸升高，在花后126 d 時最高(圖1)。

圖1 2 個梨品種不同果實發育期果皮花色苷含量變化Fig.1 Changes of anthocyanin contents in the skin of two pear varieties during fruit development

2.2 2 個梨品種果皮中花色苷合成基因的轉錄特性

2 個梨品種由于果皮花色苷含量不同，果實色澤表型差異顯著。為探明花色苷合成途徑與果實著色發生及程度的關系，本試驗對參與花色苷合成的7 個結構基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT進行了實時熒光定量分析。結果(圖2)顯示，紅星果實發育期間，除PAL 外，其他基因都是在花后58 d 時表達量最高，基因表達量的變化趨勢與果皮花色苷含量的變化相一致，升高后降低，尤其下游基因DFR、ANS、F3GT，花后58 d 的表達量達到花后25 d的4 ～5 倍。滿天紅的基因表達量與果皮花色苷含量變化并不一致，除PAL 和F3GT 在花后102 d 時最高，呈升高后降低外，其他基因的表達量都隨果實的發育而逐漸降低，下游基因F3H、DFR 和ANS 在接近果實成熟時降到極低，而果實花色苷含量此時最高。比較2 個品種，整個果實發育期間，CHS 表達量滿天紅是紅星的10 倍以上。此外，果實發育初期，除PAL 和F3GT 外，其他基因的表達量滿天紅均高于紅星，而此時紅星著紅色，滿天紅為綠色。果實接近成熟時，滿天紅花色苷合成上游基因CHS、CHI的表達量高于紅星，而下游基因F3H、DFR、ANS 正好相反，這與我們以前的結果一致［8］。

2.3 2 個梨品種果皮中轉錄因子MYB10 的轉錄特性及對花色苷合成基因表達量的影響

2 個品種果皮中MYB10 基因在不同果實發育期的表達量測定結果(圖2)顯示:紅星果皮中，MYB10 轉錄水平在整個發育期都很低，不隨結構基因表達量和花色苷含量的變化而不同;滿天紅果皮中，MYB10 基因表達量在轉色期(花后102 d)時最高，幼果期和接近果實成熟期差異不顯著，變化趨勢為升高后降低，與PAL 和F3GT 的變化趨勢相同。2個品種比較，MYB10 基因表達量滿天紅是紅星的50倍以上。

3 討論

3.1 不同紅色梨品種的著色模式差異

由于遺傳背景不同，紅色梨因種屬差異呈現出不同的著色模式，其中最顯著的差異之一就在于著色的時間不同。西洋紅色梨多花后幼果期著色，例如紅巴梨、早紅考蜜斯、紅星、Red d’Anjou、Bon Rouge 等;紅色砂梨幼果期為綠色，果實發育中后期著色，例如火把梨、滿天紅、奧冠、云紅1 號等。本研究的主要目的就在于探討紅星和滿天紅果實著色時間差異的分子機理，所以選擇3 個代表性果實發育期以簡化研究過程。之所以選擇滿天紅，是因為滿天紅為火把梨的后代，繼承了親本的著色特征且克服了紅色砂梨品質差不適推廣的缺陷，在生產中被廣泛應用，以滿天紅為研究對象更具應用價值。

3.2 2 個梨品種花色苷合成相關結構基因的表達差異

西洋梨紅星在果實發育期著色程度變化的本質是果皮花色苷含量的改變。本試驗結果表明，紅星的花色苷含量隨果實發育先升高后降低，花色苷合成結構基因表達量除PAL 外與其呈相同的變化趨勢。這一結果與紅巴梨果皮中花色苷生物合成相關基因(CHS、CHI、DFR、F3H、ANS、F3GT)的表達量分析結果相一致［5］。因此，推測此類品種的果實著色程度由多基因協同作用。

紅色砂梨滿天紅著色時間在果實發育中后期，與西洋紅梨不同，存在一個從無到有的轉色過程，探討轉色期的成因對于揭示果實著色機理有重要意義。本研究發現，滿天紅果實著色轉色期的一個顯著特征是在其他花色苷合成基因表達量都下降的情況下，PAL 和F3GT 基因的表達量升高，這2 個基因對滿天紅的果實轉色異常重要。PAL 是花色苷合成代謝的第一個酶，前人研究結果表明［13］，在花色苷合成過程中，只有在缺少前體的條件下，花色苷合成才與PAL 活性有關。因此推測滿天紅果實著色轉變期PAL 表達量的升高可能是由于果實發育前期花色苷合成前體不足所致。F3GT 在不同著色蘋果中的表達分析結果表明［14］，它的表達量與蘋果顏色呈正相關，F3GT 是蘋果果皮紅色的關鍵基因之一。這與本文結果相一致，我們認為F3GT 的表達對于滿天紅果皮著色與否非常關鍵。除了自然條件下的果實轉色，研究者也采用套摘袋技術，人為創造果實轉色。在套摘袋條件下，紅色砂梨品種滿天紅、奧冠、云紅1 號果皮花色苷合成結構基因轉錄特性的研究已有報道［6-8］，它們的著色以及基因表達量變化與光照密切相關。對奧冠［6］和云紅1 號［7］的研究結果表明，果實去袋后，光照誘導DFR 和ANS 轉錄增多與花色苷含量升高一致。葡萄中也證實［15］，DFR 和ANS 啟動子序列中存在特定的結構域，可受光照的誘導。這些結果在本試驗中并未發現，可見，自然生長條件和套摘條件下的轉色存在不同的分子機制，除了光照是果實著色的調控因素外，還存在其他因素調控紅色砂梨滿天紅果皮顏色的轉變。

比較2 個品種，CHS 在滿天紅中的表達量明顯高于在紅星中的表達量。Zhang 等［7］在砂梨品種云紅1號與早白蜜構建的差減cDNA 文庫中發現的唯一一個花色苷合成基因就是CHS。可見，CHS 在紅色砂梨品種果皮花色苷累積中可能具有重要作用。此外，果實發育初期，除PAL 和F3GT 外，其他基因都是滿天紅高于紅星;果實接近成熟時，滿天紅花色苷合成上游基因CHS、CHI 的表達量高于紅星，而下游基因F3H、DFR、ANS 正好相反。這些基因在品種間的表達差異可能是導致不同著色模式的重要原因。

圖2 2 個梨品種果皮花色苷合成基因和編碼轉錄因子MYB10 基因的熒光定量檢測Fig.2 Relative expression levels of anthocyanin synthesis genes and transcription factor MYB10 genes in the fruit skin of two pear varieties by real-time PCR

3.3 2 個梨品種中MYB10 基因的表達差異及對花色苷合成的影響

大量研究結果表明［16］，植物通過轉錄因子調控花色苷的生物合成，MYB 家族是與花色苷合成相關的重要轉錄因子之一，且不同作物涉及的MYB 家族成員不同，例如蘋果有3 個與花色苷合成相關的轉錄因子MdMYB10、MdMYBA、MdMYB1［9］。目前，梨中僅發現MYB10 轉錄因子與梨果實花色苷合成基因的轉錄相關［5-6，9］，因此，本研究測定了2 個品種果皮中MYB10 基因在不同果實發育期的表達量，發現滿天紅中MYB10 基因表達量在果實轉色時最高，并與F3GT 的變化趨勢一致。有報道［16］認為，MYBbHLH-WD40 復合體調控花色苷合成下游基因的表達，控制花色苷的合成。比較紅星和滿天紅中MYB10 基因的轉錄特性，除了果實發育期間變化趨勢不同外，滿天紅中表達量遠高于紅星，這種差異是否說明品種間調控機制的差異還需深入探討。事實上，對紅巴梨的研究結果表明［5］，MYB10 基因的表達雖與花色苷合成有關，但MYB10 基因在連鎖群上的定位并未與決定果皮顏色的位點相連鎖，說明西洋紅梨的著色還存在其他決定因素。紅色砂梨尚未有類似的研究報道。從本研究的結果看，相對于紅星來說，MYB10 可能對滿天紅的著色更為重要，在滿天紅中MYB10 可能通過調控F3GT 的表達調控滿天紅花色苷的合成。

綜上所述，紅星果實著色程度可能由多個基因協同作用，滿天紅著色與否受關鍵基因F3GT 影響。對于 滿天紅，除光照是著色的調控因素外，可能還存在其他因素調控轉色。MYB10 可能通過調控F3GT 的表達從而調控滿天紅的著色。

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