蛋雞子宮內膜細胞的分離培養與鑒定及性腺激素對其增殖的影響

葉幼榮， 張 璐， 孫 杰， 桑永明， 趙宗勝

( 石河子大學動物科技學院，新疆 石河子832003)

蛋雞的子宮為囊狀，是輸卵管的一部分，含管狀腺，分泌蛋白質、鈣質和色素，其主要生理功能是形成蛋殼。子宮內膜由單層柱狀上皮和固有層構成，而上皮主要由具有分泌功能的腺上皮構成; 固有層則由子宮內膜基質細胞與間質構成，子宮內膜的腺上皮細胞可受卵巢激素的影響產生周期性的變化。在不同的生理周期，孕酮( P4) 和雌激素( E2) 的聯合作用使子宮內膜細胞發生形態及生物化學的變化，這種變化不僅表現在內膜細胞形態學上的變化，同時還表現在其增殖及分泌活性的改變。性激素由受體介導調控生殖細胞的生長分化和功能。受體是通過調節不同的轉錄因子和目標基因來驅動生理變化的［1-2］。性激素對子宮內膜細胞的體外增殖也有影響，Pierro 等［3］研究結果指出雌激素對子宮內膜上皮細胞的體外增殖有促進作用。

對于哺乳動物( 如大鼠［4］、豬［5］、兔［6］、猴［7］、人［8］) 以及反芻動物［9-10］已有子宮內膜細胞的分離培養及純化的報道，而蛋雞子宮內膜細胞的體外培養和純化國內未有明確報道。為了探討蛋雞子宮內膜細胞的分離培養方法及性激素對其體外增殖的影響，本研究采用Ⅰ型膠原酶消化的方法對蛋雞子宮內膜細胞進行分離培養，測定不同濃度的孕酮和雌激素對子宮內膜細胞體外增殖的影響，為今后蛋雞子宮內膜細胞的增殖、分化及代謝的研究提供理想的體外模型，也為性激素對子宮內膜細胞的調節作用機理的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 選擇處于產蛋高峰期，生長良好，產蛋率達80%以上的海蘭褐殼蛋雞作為試驗動物，試驗動物來自石河子大學動物科技學院實驗站。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12 混合培養液( Hy-Clone 公司) 、無支原體胎牛血清( 杭州四季青生物工程材料有限公司生產) 、I 型膠原酶( 索萊寶公司生產) 、青鏈霉素混合液( Solarbio 公司生產) 、3-( 4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴鹽( MTT) 試劑( Solarbio 公司生產) 、二甲亞砜( DMSO) ( Biosharp公司生產) 、孕酮( P4，Sigma) 、雌激素( E2，Sigma) 、角蛋白ck18( Cytoker tin 18，北京中杉公司生產) 單克隆抗體、波形蛋白質單克隆抗體( 北京中杉公司生產) 、SP 免疫組化試劑盒及DAB 顯色液( 北京中杉公司生產) 。

1.2 方法

1.2.1 子宮內膜上皮細胞和基質細胞的獲取(1) 剪碎法: 無菌取出蛋雞子宮，剔除血管、結締組織和子宮內膜表皮層，于超凈臺內撕取子宮內膜，用無菌的PBS 清洗3 ～5 次，剪碎成l mm3左右的小塊，加入終濃度為1 mg/ml的I 型膠原酶，置37 ℃消化60 min，加血清終止消化，并用200 目的細胞篩過濾，濾液以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，如此重復離心洗滌2 次。離心管中的細胞沉淀加入含有10%胎牛血清的培養液重懸，反復輕輕吹打混合均勻。用0.1%臺盼藍檢查細胞存活率，當細胞存活率達90%以上進行后續試驗。分離的細胞以1 cm36 ×105個培養于培養皿，待細胞貼壁長滿后進行傳代，純化后的基質細胞分別接種于培養皿( 直徑5 cm) 、6 孔培養板，置5% CO2的細胞培養箱中，37 ℃條件下培養，其中6 孔培養板中放有處理過的蓋玻片( 細胞爬片) ，隔天換液，觀察細胞的生長情況，該法分離培養的細胞為子宮內膜基質細胞，鑒定后進行后續試驗。(2) 刮取法: 無菌取出蛋雞子宮，用手術刀片刮取子宮內膜上皮細胞，加入終濃度為1 mg/ml的I 型膠原酶于37 ℃消化60 min，之后處理方法同剪碎法，該法分離培養的細胞為子宮內膜上皮細胞，鑒定后進行后續試驗。

1.2.2 細胞爬片及免疫組織化學鑒定 培養到第3 d 或4 d，6 孔板中的細胞在蓋玻片上完全貼壁后，取出蓋玻片進行免疫組化試驗，用無菌磷酸鹽緩沖液( PBS) 沖洗3 遍，吸干后用4% 的多聚甲醛室溫固定20 min，對刮取法和剪碎法得到的細胞爬片分別做鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法( SP法) 鑒定，分別用細胞角蛋白質ck18 單克隆抗體和波形蛋白質單克隆抗體作為一抗，二氨基聯苯胺( DAB) 顯色液顯色后在熒光顯微鏡下觀察試驗結果，凡細胞質呈棕褐色，細胞核呈藍紫色的為陽性細胞，用PBS 代替一抗作陰性對照。

1.2.3 細胞生長情況觀察及生長曲線測定 每天用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。MTT 法測細胞生長曲線:2 種方法得到的細胞以每孔1 ×104個細胞接種于96 孔培養板中，每孔體積為200 μl，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。每隔24 h 更換培養液并選擇8 個孔，每孔加入20 μl MTT 溶液( 5 mg/ml) ，37 ℃繼續孵育4 h 后終止培養，吸棄孔內培養液，各孔加入150 μl 二甲亞砜( DMSO) 溶液，微量振蕩器上震動10 min 后在酶標儀上于490 nm 處測定各孔OD 值，記錄結果。連續測定8 d，以時間為橫軸，光吸收值( OD 值) 為縱軸繪制生長曲線。

1.2.4 性腺激素對子宮內膜細胞增殖的影響 96孔培養板中的細胞培養24 h 后進行分組，分為空白組( 沒有細胞，只加PBS) 、對照組( 不添加激素) 和試驗組，試驗組共分為9 組，各組培養液中雌激素( E2) 和孕酮( P4) 濃度見表1，每個濃度5 個重復。隔天換液，重新加入含相同濃度激素的培養液，并觀察細胞生長狀態。若細胞狀態良好，3 d 后做MTT實驗，于492 nm 波長處測OD 值。

表1 處理組的雌激素(E2)和孕酮(P4)濃度Table 1 The concentrations of estrogen (E2) and progesterone (P4)in the experimental treatments

1.3 數據處理

試驗數據用SPSS 17.0 統計分析軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 子宮內膜細胞培養結果

細胞生長情況:2 種方法獲取的細胞接種36 h后80%的貼壁。采用刮取法培養48 h 的細胞大多數為子宮內膜上皮細胞，摻雜著極少量基質細胞，上皮細胞呈多角形或橢圓形，邊界清楚，排列緊密，胞漿飽滿，核圓大，呈旋渦狀生長( 圖1) 。采用剪碎法培養48 h 的細胞多數為子宮內膜基質細胞，基質細胞形態為梭形或多邊形，呈平行束狀或放射狀排列，核明顯( 圖2) 。

圖1 刮取法培養48 h 的子宮內膜上皮細胞( ×100)Fig.1 The morphology of chicken endometrial epithelial cells cultured for 48 h by scraping ( ×100)

圖2 剪碎法培養48 h 的子宮內膜基質細胞( ×100)Fig.2 The morphology of chicken endometrial stromal cells cultured for 48 h by cutting ( ×100)

2.2 細胞爬片的免疫組化結果

2 種細胞爬片進行SP 法免疫組化鑒定后，結果顯示上皮細胞對角蛋白質抗體呈陽性，基質細胞對波形蛋白質抗體呈陽性，陽性率達95%。

2.3 MTT 法測定細胞的生長曲線

分離培養的子宮內膜上皮細胞在接種后最初24 h 生長緩慢，培養的第2 ～5 d 是對數生長期，之后生長緩慢，第7 d 開始進入平臺期;子宮內膜基質細胞最初的生長趨勢同上皮細胞，在培養的第2 ～6 d 是對數生長期，之后生長緩慢進入平臺期( 圖3) 。

2.4 雌激素(E2)、孕酮(P4) 對蛋雞子宮內膜細胞體外增殖的影響

圖3 蛋雞子宮內膜上皮細胞和基質細胞MTT 生長曲線Fig.3 Growth curves of endometrial epithelial and stromal cells isolated from laying hens by MTT assay

96孔板中培養的2種細胞在加入不同濃度的E2和P4后出現了不同的增殖變化( 表2) 。由表2可知: 與對照相比，高濃度的雌激素( 100 nmol/L) 和孕酮( 100 nmol/L) 能夠顯著促進子宮內膜上皮細胞的體外增殖; 10 nmol/L、100 nmol/L的雌激素分別和100 nmol/L孕酮合用對上皮細胞的體外增殖有顯著促進作用。高濃度的孕酮( 100 nmol/L) 能顯著促進基質細胞的體外增 殖; 100 nmol/L 孕 酮 和10 nmol/L、100 nmol/L雌激素的組合對基質細胞體外增殖也有顯著促進作用。這表明高濃度的孕酮和雌激素對子宮內膜上皮細胞和基質細胞體外增殖均有顯著促進作用。

表2 不同濃度雌激素(E2)和孕酮(P4)對蛋雞子宮內膜細胞增殖的影響Table 2 Effects of E2 and P4 on the proliferation of epithelium and stromal cells isolated from chicken endometrium

3 討論

蛋雞的子宮實質是個蛋殼腺，蛋殼在此形成，影響蛋雞子宮內膜生理功能的因素有很多，由于體內研究受多種條件的限制，成功培養蛋雞子宮內膜細胞成為開展多項相關研究的基礎，但目前國內對蛋雞子宮內膜細胞的培養未見明確報道。前人的研究已獲得高純度的牛［11］、犬［12］、馬［13］和兔［14］等哺乳動物的子宮內膜上皮細胞和基質細胞，關于人的子宮內膜上皮和基質細胞的培養也有大量研究［15-16］。本研究采用刮取法和Ⅰ型膠原酶消化法分離子宮內膜上皮細胞，去掉子宮內膜表層后，剪碎法和消化法分離得到基質細胞，由于在胰蛋白酶的作用下，基質細胞較上皮細胞更易脫落，因此將培養的貼壁細胞用0.25%的胰蛋白酶在37 ℃消化后，進行傳代培養以純化細胞。

細胞角蛋白質ck18 是表皮細胞內的一種蛋白質，而波形蛋白質廣泛存在于間充質細胞，經免疫組化試驗鑒定所培養的上皮細胞和基質細胞分別對角蛋白質抗體和波形蛋白質抗體呈陽性，這一結果與陳秀荔等［17］鑒定家兔子宮內膜細胞的結果相同。細胞生長曲線的測定結果表明，上皮細胞和基質細胞在接種后第1 d 為潛伏生長期，從第2 d 開始進入對數生長期，第5 d 到6 d 生長逐漸緩慢下來，第7 d進入平臺期。這一結果與宋宇軒等［18］關于家兔子宮內膜細胞生長曲線的測定結果相一致。我們的研究結果發現蛋雞子宮內膜上皮細胞和基質細胞的體外生長趨勢是相似的，這為蛋雞子宮內膜細胞的進一步相關研究提供了基礎。

子宮內膜在體內受到雌激素、孕酮等的共同作用，子宮局部的微環境隨發情周期及生殖周期有規律的變化，大量的研究結果證明性腺激素對子宮內膜上皮細胞和基質細胞的增殖［16，19］、分化以及激素受體表達都具有重要調節作用［20-21］。有研究結果［22］表明鵝體內孕酮、雌激素分泌水平從性成熟后開始增高，一直到產蛋高峰期達到峰值，這種變化對鵝的產蛋有重要影響。關于激素對體外培養的蛋雞子宮內膜細胞增殖的影響還沒有廣泛研究。但是在哺乳動物中，性腺激素對體外分離培養的子宮內膜細胞的作用已有大量研究，阿依木古麗等［23］發現1 ×10-7mol/L和1 ×10-8mol/L 17 β-雌激素均能顯著增加牦牛子宮內膜上皮細胞和基質細胞的增殖;Fa?kowska 等［24］研究結果表明，高濃度的孕酮( 10-5mol/L) 可顯著提高牛基質細胞生長; Slayden 等［25］用雌激素作用于獼猴子宮內膜可促進子宮內膜上皮細胞大量增殖。本研究采用不同濃度的雌激素和孕酮作用于體外培養的蛋雞子宮內膜上皮細胞和基質細胞，結果與對照相比，雌激素(100 nmol/L) 和孕酮(100 nmol/L) 能夠顯著促進子宮內膜上皮細胞的體外增殖，孕酮(100 nmol/L) 能顯著促進基質細胞的體外增殖，與宋宇軒等［18］利用孕酮和雌激素作用于家兔子宮內膜細胞的研究結果一致。10 nmol/L和100 nmol/L的雌激素和100 nmol/L孕酮組合對上皮細胞和基質細胞的體外增殖有顯著促進作用，與以往關于哺乳動物類似研究的結果有所不同。本研究所使用的試驗動物是蛋雞，Bar［26］認為雌激素調控蛋雞卵的形成和排出，雌激素和孕酮參與鈣代謝從而影響蛋殼的形成。雌激素在維持蛋雞輸卵管的功能上也是至關重要的，它促進管狀腺的形成和上皮細胞的分化，表明性腺激素對蛋雞生殖過程的作用與哺乳動物不同，我們的研究結果也反映了蛋雞和其他物種子宮間的生理差異。

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