人獸共患旋毛蟲病診斷技術的研究進展

葉星宇

(廣元市動物疫病預防控制中心,四川廣元628017)

人獸共患旋毛蟲病診斷技術的研究進展

葉星宇

(廣元市動物疫病預防控制中心,四川廣元628017)

旋毛蟲病是一種嚴重的人獸共患寄生蟲病。旋毛蟲的檢測方法主要包括實驗室檢測,免疫學檢測和分子生物學檢測。目前,主要采用免疫學方法檢測旋毛蟲病。本文就旋毛蟲病診斷技術的研究做一綜述。

旋毛蟲病;檢測技術;研究進展

1 前言

旋毛蟲病是由旋毛形線蟲引起的一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，旋毛蟲主要寄生于豬、熊等150多種動物及人。由于其病原傳播的復雜性，流行范圍廣，世界各地區均有發生該病的報道。旋毛蟲病不僅給畜牧食品業帶來重大的經濟損失，而且還嚴重危害人類的健康。龐顏坤（1999）報道，1964～1997年，僅云南省人群暴發旋毛蟲病就達441次，發病20101人，死亡多達213人。因此，旋毛蟲的診斷有十分重要的意義。

2 旋毛蟲診斷技術

2.1 實驗室診斷

2.1.1 解剖分析

旋毛蟲“目檢”法目檢法即用眼睛觀察肉樣以檢旋毛蟲，旋毛蟲幼蟲感染豬體后大約21d～7個月形成鈣化，肉眼觀察即能檢出。操作方法是：將新鮮膈肌腳撕去肌膜，肌肉縱向拉平拉緊，然后在光線較好處仔細觀察肌纖維表面，最好稍斜方向去看更易發現，肉眼松本時的光線以自然光源較好，檢出率高。

2.1.2 顯微鏡檢測

常用活組織壓片鏡檢、人工胃液消化分離法及動物感染，壓片法檢。體操作方法是：選取豌豆大小的無脂肪和皮膚的肌肉組織，從每一肉樣剪取麥粒大小的肉24粒，均勻地在玻片上排放，用另一玻片壓緊在兩玻片之間，置于旋毛蟲鏡檢器或顯微鏡交視野投放到屏幕上觀察，發現包囊幼蟲即可確診。（消化法是肌片用胃蛋白酶和稀鹽酸消化，離心沉淀后檢查幼蟲）。

但以實驗室診斷方法有摘取組織的局限性，在感染的早期及輕度感染者檢出率低，陽性率僅50%左右，且不易被患者接受。

2.2 免疫學診斷

2.2.1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯免疫吸附試驗是將可溶性抗原或抗體吸附于固相載體上，利用酶標抗體或抗原結合形成酶標記的免疫復合物，加入相應酶底物顯色，根據反應液顏色判定抗原-抗體反應情況，從而檢測抗原或抗體。經過長期實踐，實驗技術的改進，常規的ELISA發展為SPA—ELISA、DOT—ELISA等。黎世濤等用SPAELISA檢測旋毛蟲法所需的材料制成快速診斷試劑盒，與常規ELISA平行檢測107例旋毛蟲病人血清，陽性率分別為99.07%和97.19%；人畜血清兩法陽性率均為100%。朱名勝等用Dot-ELIST檢測旋毛蟲病患者38例和感染旋毛蟲的豚鼠40例血清，陽性率分別為97.4%和100%。

2.2.2 間接熒光抗體檢測技術（IFAT）

間接熒光抗體檢測技術是將待檢樣本（如：血液涂片、組織切片等）固定，加入一抗反應一定時間，用pbs反復洗脫，自然干燥，再加入用熒光標記的二抗反應。再熒光顯微鏡下觀察，根據是否有熒光判斷結果。有熒光為陽性，無熒光為陰性。El-Shazly AM等采用IFA和ELISA檢測實驗感染旋毛蟲鼠的IgG水平，在整個實驗期間，IFA的敏感性和特異性分別為100%和85%，ELISA的敏感性和特異性分別為100%和93.3%。IFAT法檢測旋毛蟲病快速、有較高的敏感性和特異性，而且制備的熒光標記抗體，可以用于多種抗原抗體系統的檢測。但需配備熒光鏡，使其應用范圍受到一定的限制。

2.2.3 間接血凝試驗（IHA）

間接血凝試驗是指將抗原或抗體通過結合劑結合到紅細胞表面，再與相應的抗體或抗原結合就會出現肉眼可見的紅細胞凝集現象。IHA診斷旋毛蟲病有較好的敏感性和特異性，而且具有操作簡便，不需特殊設備等優點，具有早期診斷價值。

2.2.4 環蚴沉淀試驗（Slide）

將已消化好的純凈幼蟲50～100條，置玻片上消毒凡士林制成圓形小凹中，加待檢血清1滴，蓋上蓋玻片，放人潮濕方盤中，在37℃溫箱中培養24h，取出玻片用低倍鏡觀察，是否有幼蟲口部或肛門出現透明凝塊狀或泡沫狀的沉淀物附著，判定結果。王紹基等采用IHA和Slide檢測旋毛蟲病豚鼠血清，陽性率分別為100%和97.1%。用兩種方法檢測正常豚鼠血清、血吸蟲病兔血清、肺吸蟲病大白鼠血清、蛔蟲病人血清和鞭蟲病人血清，除1例肺吸蟲病大白鼠血清出現陽性反應外，均為陰性。崔晶等用環蚴沉淀試驗與IFAT進行對比試驗，檢測鄭州一起旋毛蟲大暴發490名有聚餐史者及212例旋毛蟲患者血清陽性率，結果無顯著差異。Slide幼蟲沉淀物大多附在幼蟲尾部呈不太規則的透明凝塊狀，或附在幼蟲口部呈空泡狀，有些幼蟲口、尾同時附有沉淀物，隨幼蟲移動而自然擺動，在低倍鏡下易于觀察。

2.2.5 乳膠-磁性顆粒技術

乳膠顆粒是一種有色懸浮液（如藍色、紅色等），用旋毛蟲p49抗原致敏乳膠顆粒，用抗抗體包被磁性顆粒，利用抗原—抗體反應使兩種顆粒與陽性抗體形成大分子結合物，在磁場作用下，結合物隨著磁性顆粒沉降下來，從而使溶液變清（陰性對照仍為懸浮濁液），通過目測判定結果，必要時也可用儀器檢測其清濁度。該檢測方法操作簡便、時間短、靈敏度高、不需專用設備的快速診斷技術。宋思揚等報道用該技術測定旋毛蟲P49抗原抗體，檢測到19份感染鼠血清、6份感染豬血清、3份旋毛蟲病豬血清、4份病人血清呈IgG抗體陽性，說明融合蛋白P49/GST的乳膠-磁性顆粒技術可用于旋毛蟲的早期診斷。

2.2.6 快速免疫層析法

快速免疫層析是在層析材料上包被相應的抗原，采用膠體金技術將處理過的制劑吸附在試紙條上，檢測被檢血清中的相應抗體。若抗原、抗體相對應，則發生高特異的免疫親和反應，免疫復合物被截留集聚在一定區域（檢測帶），通過膠體金而得到肉眼直觀的顯色帶，可判定檢測結果。采用膠體金標記Dipstick試紙條檢測旋毛蟲病患者與旋毛蟲感染的小鼠、大鼠、兔、豬血清的陽性率分別為100%（28/28）、96.00%（48/50）、100%（10/10）、100%（10/10）及100%（30/30）；其它寄生蟲病（斯氏貍殖吸蟲病、血吸蟲病、華支睪吸蟲病等）患者及正常人血清均為陰性。張月清等采用快速免疫層析法和ELISA法檢測旋毛蟲病患者及動物，兩種檢測方法檢測感染旋毛蟲的感染率一致。快速免疫層析法診斷旋毛蟲病具有較高的敏感性和特異性，簡便快捷，勿須特殊儀器設備，是一種檢測旋毛蟲病血清IgG抗體和流行病學調查較好的免疫診斷方法。

此外，還有免疫酶染色試驗（IEST）、增強化學發光酶免疫染色試驗（ECIA）、皮內試驗、循環抗原（CAg）檢測、淋巴細胞雜交瘤和單克降抗體（McAb）技術等。雖然旋毛蟲的免疫學檢測方法很多，由于旋毛蟲蟲體抗原的結構極其復雜，且在其長期的寄生生活中，逐漸形成了各種各樣的免疫逃避手段，采用成分復雜的蟲體抗原往往難以取得理想的診斷、預防和治療效果。

3 分子生物學診斷

3.1 多重PCR技術（multiplex PCR）

聚合酶鏈式反應（PCR）是20世紀80年代中期發展起來的一種在體外迅速大量擴增特異性DNA的新技術，它具有高度的靈敏性和特異性。Caballero-Garcia ML等用PCR方法對實驗感染小鼠進行旋毛蟲病早期診斷，結果最早在感染后第3天檢測到旋毛蟲DNA，在第3～17d，33只實驗鼠血樣中均檢測到旋毛蟲DNA。張國華等根據旋毛蟲幼蟲基因序列設計合成引物，采用PCR檢測感染幼蟲及健康幼蟲，可檢測0.01條幼蟲產物。

多重PCR敏感性和特異性都相對較高，可鑒別分子差異不明顯的蟲種。由于可在同一PCR反應管內同時對多個目的基因進行分型，多重PCR還具有系統、經濟及簡便等優點，尤其適合于大量標本鑒定。近年來此方法廣泛應用于旋毛蟲的流行病學調查及蟲種分類，是旋毛蟲分類學及流行病學分離鑒定中十分有用的工具。

3.2 構建旋毛蟲cDNA文庫

近年來，國內外學者把視線放在基因工程抗原上，通過構建cDNA文庫，篩選理想的抗原，預測其抗原表位。探索應用旋毛蟲重組抗原進行快速廣普旋毛蟲檢測的新方法。

在眾多的旋毛蟲抗原中，旋毛蟲的排泄分泌（ES）抗原可直接刺激宿主的免疫系統，是誘導宿主產生免疫應答的主要靶抗原。因此，旋毛蟲ES抗原作為診斷抗原比較理想。Zaflenga等（1989）用從旋毛蟲肌幼蟲分離的多聚腺苷酸mRNA構建了cDNA（互補DNA）表達文庫，篩選出ES中53KD；Sugane等將獲得的T·spiralismRNA反轉錄合成cDNA表達文庫，從而篩選出ES中45～46KDa蛋白的結構基因，基因陽性克隆表達，經檢測表明能與旋毛蟲病陽性血清發生特異性反應；原麗紅等利用p46ku抗原基因的原核表達重組蛋白WN10免疫小鼠，可誘導小鼠產生較強的抗旋毛蟲保護性免疫；牛廷獻等以從旋毛蟲新生幼蟲cDNA文庫中篩選獲得的T668基因表達的重組蛋白為抗原，對小鼠的保護性作用進行了研究，結果顯示T668重組抗原具有一定的免疫保護作用，且可激發特異性體液免疫，為旋毛蟲病的防治提供了新的免疫原。劉明遠等已成功地構建了中國豬旋毛蟲和犬旋毛蟲（T.nativa）分離株的成蟲及新生幼蟲混合文庫。Chung等構建了偽旋毛蟲（T.pseudospiralis）DNA文庫，表達了一種23kDa的β-半乳糖苷酶-融合蛋白，免疫細胞定位表明抗該融合蛋白的血清只能識別偽旋毛蟲，提示該融合蛋白可作為偽旋毛蟲病鑒別診斷的一種特異性抗原。NaganoI等用旋毛蟲感染血清從旋毛蟲肌幼蟲cDNA文庫免疫篩選到絲氨酸蛋白酶抑制劑基因和絲氨酸蛋白酶基因。

4 小結

旋毛蟲病是一種嚴重的人獸共患病，威脅人類健康，且對農牧養殖業發展造成嚴重的經濟損失。因此快速診斷疾病，對于治療和預防具有十分重要的意義。目前旋毛蟲病得診斷主要是依靠免疫學診斷，近年來，旋毛蟲抗原特別是ES抗原的研究，cDNA表達庫的建立等，從分子水平上尋找診斷與控制旋毛蟲病的措施奠定了基礎，為基因疫苗的研究也奠定了基礎。

[1]崔晶，王中全，晉雪香，等.鄭州市一起旋毛蟲病大暴發的流行病學調查及臨床觀察[J].中國人獸共患病雜志，1997，13（2）：65.

[2]鄭繼昌，李治深.旋毛蟲血清學診斷研究進展[J].中國獸醫寄生蟲病，2003，（10）：38-43.