胰腺癌中COX-2、Her-2/neu的表達及與預后的關系

蘇春永 楊曉光

胰腺癌是一種惡性度極高的惡性腫瘤，一經確診僅有20%左右的患者可行根治性切除術，術后5年生存率不到25%［1］。胰腺癌的發生、增殖、侵襲以及轉移等各種生物學行為涉及到多種癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活。原癌基因表皮生長因子(v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2，Her-2/neu)是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白，通過激活酪氨酸激酶信號級聯反應在腫瘤細胞間的信號傳遞中起重要作用［2］。環氧合酶2(cyclooxygease-2，COX-2)是介導前列腺素合成、細胞有絲分裂、細胞粘附等多種生理和病理功能的多效酶［3］。研究顯示，Her-2/neu、COX-2在正常組織極少表達，而在食管癌、子宮內膜癌、膀胱癌等惡性腫瘤組織高表達，通過促進細胞增殖及新生血管形成、抑制細胞凋亡、幫助腫瘤細胞免疫逃逸等過程參與惡性腫瘤的發生發展［4-6］。但關于Her-2/neu、COX-2在胰腺癌中相互作用的機制及與預后的關系筆者所見國內外研究較少。本研究應用免疫組化法及實時熒光定量PCR法檢測胰腺癌組織中COX-2及Her-2/neu的表達及與臨床病理指標的關系，探討其與胰腺癌發生、發展及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年9月至2011年3月經我院手術切除的原發性胰腺導管腺癌組織標本50例，均經病理確診，臨床病理資料及隨訪資料完整。其中男30例，女20例;年齡 ＜50歲6例，≥50歲44例。參照1987年國際抗癌聯盟(UICC)制定的胰腺癌病理分級標準，Ⅰ級12例，Ⅱ級18例，Ⅲ級20例。50例中低增殖活性13例，高增殖活性37例;有局部淋巴結及遠處轉移者31例，無轉移者19例;生存期＞1年者15例，＜1年者35例。同時選取癌旁組織36例，其中男23例，女13例;年齡＜50歲3例，≥50歲33例。

1.2 試劑 兔抗人COX-2多克隆抗體、鼠抗人Her-2/neu單克隆抗體(美國Santa cruz公司);免疫組化試劑盒(北京中杉金橋技術有限公司);Trizol、Real Time-PCR試劑盒(美國Promega公司)。

1.3 COX-2和Her-2/neu蛋白的表達檢測 采用免疫組化法檢測胰腺組織COX-2、Her-2/neu蛋白表達水平，參照說明書操作。將手術切除的癌組織及癌旁正常組織置于4%多聚甲醛中固定，依次進行脫蠟、水化、高壓鍋熱修復后加入特異性一抗(稀釋比例:COX-2:1∶200;Her-2/neu:1∶150)4℃過夜;加入生物素標記的二抗，室溫孵育1 h;加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的三抗室溫孵育45 min，DAB顯色，蘇木精染色。結果判定標準:COX-2和Her-2/neu陽性染色的判定以細胞膜(質)中檢出棕黃色或深棕色顆粒為標準。隨機選取5個有代表性的視野進行觀察并計數200個細胞，若陽性細胞數占同類細胞數的比例≥5%為陽性，＜5%則為陰性。

1.4 COX-2和Her-2/neu mRNA表達的檢測 采用Real Time-PCR(qPCR)方法檢測胰腺組織COX-2、Her-2/neu mRNA表達水平，參照說明書操作。Gene Bank網站獲取COX-2和Her-2/neu基因序列，使用Primer Premier5.0設計引物，有上海生工生物工程有限公司合成。Trizol提取組織總RNA，將2.0 μg總RNA用于后續的 Real Time-PCR反應。PCR擴增完畢后，以GAPDH為內參照基因，目的基因Her-2/neu表達的相對定量值(RQ值)用于統計分析。見表1。

1.5 腫瘤MVD值計數 采用CD105標記的MVD(CD105-MVD)法計數腫瘤MVD值:100倍光鏡下觀察整個切片，選取3個最有代表性的組織切片，排除存在出血和邊緣反應區的切片。低倍鏡下選出每張切片中3個血管密度最高區(熱區)，400倍光鏡下計數熱區中被抗CD105抗體染成棕色的單個或成簇微血管數，取3個視野的平均值即為該例切片的MVD值。

表1 COX-2、Her-2/neu內參基因GAPDH的PCR引物序列

1.6 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 COX-2、Her-2/neu蛋白在胰腺癌及癌旁組織的表達 免疫組化結果顯示，COX-2、Her-2/neu蛋白主要定位于胰腺癌細胞膜(質)中，呈棕黃色或深棕色顆粒。COX-2蛋白在胰腺癌和癌旁組織的陽性表達率分別為72.0%(36/50)、8.3%(3/36)，Her-2/neu 蛋白在胰腺癌和癌旁組織的陽性表達率分別為46.0%(23/50)、11.1%(4/36)，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 COX-2及Her-2/neu在胰腺癌及對照組織中蛋白表達例(%)

2.2 COX-2、Her-2/neu mRNA在胰腺癌及癌旁組織的表達 RT-QPCR結果顯示，COX-2 mRNA在胰腺癌和癌旁組織的表達水平分別為(3.51±0.91)、(0.93±0.25)，Her-2/neu mRNA在胰腺癌及癌旁組織的表達水平分別為(4.24±0.78)、(1.03±0.16)，差異均有統計學意義(P＜0.05)，說明COX-2、Her-2/neu mRNA在胰腺癌組織的表達水平顯著高于癌旁組織。見表3。

表3 COX-2和Her-2/neu在胰腺癌及對照組織中的mRNA表達±s

表3 COX-2和Her-2/neu在胰腺癌及對照組織中的mRNA表達±s

注:與癌旁組織比較，*P＜0.05

類別COX-2 Her-2/neu胰腺癌(n=50) 3.51±0.91* 4.24±0.78*癌旁組織(n=36)0.93±0.25 1.03±0.16

2.3 COX-2、Her-2/neu蛋白表達與胰腺癌臨床病理特征的關系 免疫組化結果顯示，COX-2在低增殖活性組和高增殖活性組的陽性表達率分別為38.46%、83.78%，差異有統計學意義(P＜0.05);COX-2在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ組的陽性表達率分別為45.00%、90.00%，差異有統計學意義(P＜0.05);COX-2在有遠處轉移組和無轉移組的陽性表達率分別為90.32%、42.11%，差異有統計學意義(P＜0.05)。Her-2/neu在低分化組、中分化組和高分化組的陽性表達率分別為25.00%、38.89%、65.00%，差異有統計學意義(P＜0.05);COX-2在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ組的陽性表達率分別為30.0%、56.67%，差異有統計學意義(P＜0.05);COX-2在有遠處轉移組和無轉移組的陽性表達率分別為58.06%、26.32%，差異有統計學意義(P＜0.05)。COX-2、Her-2/neu蛋白表達均與胰腺癌患者的年齡、性別、腫瘤位置無關(P＞0.05)。見表4。

表4 胰腺癌組織中COX-2和Her-2/neu表達及臨床和生物學參數

2.4 胰腺癌組織COX-2與Her-2/neu表達的相關性

50例胰腺癌組織中，COX-2蛋白表達陽性的有36例，Her-2/neu蛋白表達陽性的有23例，COX-2與Her-2/neu蛋白表達均呈陽性的有20例。Speaman相關分析顯示，COX-2與Her-2/neu表達具有正相關性(r=0.336，P＜0.05)。見表5。

表5 胰腺癌組織中COX-2和Her-2/neu表達的相關性 例

2.5 胰胰腺癌組織COX-2、Her-2/neu表達與MVD的相關性 COX-2陽性表達的胰腺癌組織和COX-2陰性表達的胰腺癌組織MVD值分別為(52.62±9.36)、(36.43±5.29)，差異有統計學意義(P＜0.05);Speaman相關分析顯示，COX-2表達與MVD具有正相關性(r=0.563，P＜0.05)。Her-2/neu陽性表達的胰腺癌組織和Her-2/neu陰性表達的胰腺癌組織MVD值分別為(45.24±9.77)、(30.54±5.02)，差異有統計學意義(P＜0.05);Speaman相關分析顯示，Her-2/neu表達與 MVD具有正相關性(r=0.526，P＜0.05)。見表6、7。

表6 COX-2表達陰性與陽性的胰腺癌組織微血管密度分析±s

表6 COX-2表達陰性與陽性的胰腺癌組織微血管密度分析±s

注:與COX-2+比較，*P ＜0.05

COX-2 MVD+(n=36)52.62±9.36-(n=14) 36.43±5.29*

表7 Her-2/neu表達陰性與陽性的胰腺癌組織微血管密度分析±s

表7 Her-2/neu表達陰性與陽性的胰腺癌組織微血管密度分析±s

注:與Her-2/neu+比較，*P ＜0.05

Her-2/neu MVD+(n=23)45.24±9.77-(n=27) 30.54±5.02*

2.6 COX-2、Her-2/neu表達與患者預后的關系 通過對50例患者術后隨訪發現，預后＞1年和≤1年的患者 COX-2陽性表達率分別為40.00%(6/15)、85.71%(30/35)，平均生存時間分別為(21.12±2.11)個月、(9.24±1.35)個月，差異有統計學意義(P＜0.05)。預后＞1年和≤1年的患者Her-2/neu陽性表達率分別為33.33%(5/15)、51.43%(18/35)，平均生存時間分別為(22.17±2.46)個月、(10.32±1.76)個月，差異有統計學意義(P＜0.05)。說明COX-2、Her-2/neu表達陰性的患者平均生存時間明顯高于COX-2、Her-2/neu表達陽性的患者。

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度很高、診斷和治療都非常困難的消化系統惡性腫瘤，其發病率和病死率近年來明顯上升，因胰腺位于腹膜后，位置隱匿導致臨床表現不典型及早期診斷困難而致使預后極差。近年來，影像技術的迅猛發展對篩選、鑒定惡性腫瘤具有重要診斷價值，但仍對早期胰腺癌診斷效果不佳。因此，尋找能夠早期診斷胰腺癌的新技術對于疾病治療至關重要。考慮到該病發病的隱匿性，腫瘤生物標記物的檢測已經成為早期診斷胰腺癌等惡性腫瘤的新興技術，該方法具有簡便快速的優點［7］。然而，腫瘤生物標記物的檢測對診斷早期胰腺癌未能取得理想效果，原因在于針對單一腫瘤標志物的檢測敏感性和特異性不高，因此多種腫瘤標志物的聯合檢測方法越來越受到人們的重視，其既可彌補單一指標的局限性，又可互補各指標的優缺點，是提高診斷敏感性和特異性的重要方法。

癌基因的表達與腫瘤細胞的轉移及侵襲有密切關系，是決定腫瘤患者預后的重要指標［8］。COX-2是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，其主要是通過抑制細胞凋亡、抑制機體免疫功能、促進腫瘤組織新生血管形成及增加腫瘤的侵襲能力而參與腫瘤的發生、發展及轉移［9］。研究證實，胰腺癌組織中COX-2的表達明顯升高，其表達與腫瘤大小、分化程度、臨床分期、遠處轉移及淋巴結轉移均有相關性［10］。本研究結果顯示，COX-2在胰腺癌組織的陽性表達率(72.0%)顯著高于癌旁正常組織(0)，差異有統計學意義 (P＜0.05)，與前人研究一致;其表達與胰腺癌的臨床分期、增殖活性、一年期生存率及腫瘤浸潤轉移等臨床病理特征相關(P＜0.05)，而與年齡、性別、發病部位、病理組織分級無關，表明COX-2過表達可能和胰腺癌的發生及預后密切相關。

Her-2/neu是表皮生長因子受體(EGFR)家族的一員，為一具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。正常情況下Her-2/neu基因處于失活狀態，僅在少數組織中低表達，當細胞受到致癌因素刺激后，Her-2/neu的結構或其轉錄和表達調控失常，造成細胞異常增殖及惡性腫瘤的發生、發展［11］。有研究［11］顯示，乳腺癌、肺腺癌等惡性腫瘤組織中Her-2/neu高表達，與惡性腫瘤的發病及進展密切相關。本研究發現胰腺癌組織中Her-2/neu mRNA的表達明顯高于癌旁組織(P＜0.05)，與王彩蓮等［12］研究結果一致。Her-2/neu的表達與胰腺癌的病理組織分級、臨床分期、腫瘤浸潤轉移和一年期生存率關系密切(P＜0.05)，與胰腺癌患者的年齡、性別、發病部位、增殖活性無關。

研究表明COX-2、Her-2/neu信號通路之間存在交互作用。Kotha等［13］研究顯示，乳腺癌組織高表達COX-2、Her-2/neu，Her-2/neu 能夠激活 Ras-Raf-MAPK信號級聯反應，從而上調 COX-2表達水平。Wang等［14］研究顯示Her-2/neu通過與COX-2基因啟動子結合促進COX-2的轉錄和表達。本研究顯示，胰腺癌組織 COX-2、Her-2/neu表達具有正相關性(r=0.596，P＜0.05)，與以上研究結果一致。同時本研究發現COX-2、Her-2/neu均與淋巴結轉移狀況及預后密切相關(P＜0.05)。有研究顯示，COX-2能夠上調凋亡抑制因子bcl-2、血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶(MMPs)的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移過程［13］。因此，COX-2、Her-2/neu 可作為判斷胰腺癌預后的重要參考指標。

本研究中我們觀察了COX-2、Her-2/neu在胰腺癌中的表達及與預后的關系，結果顯示二者表達具有明顯的正相關性，提示COX-2和Her-2/neu發揮協同作用，共同參與胰腺癌的發生發展。此外，COX-2、Her-2/neu與胰腺癌組織分級、臨床分期、淋巴結及遠處轉移狀況及預后密切相關。因此，對COX-2和Her-2/neu表達水平的聯合檢測對早期診斷胰腺癌、判斷病情進展及預后有重要的指導價值，二者有可能成為胰腺癌生物治療的新靶點。

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