大孔吸附樹脂分離純化廣山楂總黃酮的最佳工藝條件及參數(shù)探討

陳洪濤，劉源煥，覃學謙，蔡丹昭

(1廣西中醫(yī)藥大學制藥廠，南寧530023；2廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院；3廣西醫(yī)科大學)

大孔吸附樹脂分離純化廣山楂總黃酮的最佳工藝條件及參數(shù)探討

陳洪濤1，劉源煥1，覃學謙2，蔡丹昭3

(1廣西中醫(yī)藥大學制藥廠，南寧530023；2廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院；3廣西醫(yī)科大學)

目的 探討大孔吸附樹脂分離純化廣山楂總黃酮的最佳工藝條件及參數(shù)。方法 以靜態(tài)和動態(tài)兩個方面的飽和吸附量及洗脫率為指標，比較非極性樹脂D101、弱極性樹脂AB-8、中極性樹脂HPD-450用于廣山楂總黃酮分離純化的優(yōu)劣，并通過考察總黃酮回收率，優(yōu)化所選最佳樹脂的吸附工藝參數(shù)。結果 D101、AB-8、HPD-450靜態(tài)飽和吸附量分別為94.802、118.494、98.317 mg/g干樹脂，靜態(tài)洗脫率分別為83.434%、91.253%、86.831%，洗脫液總黃酮量分別為91.490、115.567、98.528 mg，總黃酮洗脫率分別為85.852%、93.217%、89.051%。以5倍樹脂體積的70%乙醇洗脫，流速1.5 mL/min，所得總黃酮回收率為94.09%，純度為73.77%。結論 AB-8 型樹脂綜合性能最好，其最佳吸附工藝參數(shù)為以5倍樹脂體積的70%乙醇洗脫，流速1.5 mL/min。

廣山楂總黃酮；大孔吸附樹脂；分離純化

大孔吸附樹脂由聚合單體和交聯(lián)劑、分散劑、致孔劑等經(jīng)聚合反應而制備，是一類有機高聚物吸附劑，目前已在多種植物黃酮類化合物的分離提純中廣泛應用，有較好的分離純化效果[1～3]。由于現(xiàn)階段對廣山楂所含黃酮類化合物的化學性質(zhì)研究不多，難以確定采用哪類大孔吸附樹脂對廣山楂總黃酮進行分離純化會達到最佳效果。因此，2013年9月～2014年3月，我們選用了3種不同極性的大孔吸附樹脂(非極性樹脂D101、弱極性樹脂AB-8、中極性樹脂HPD-450)，通過對靜態(tài)、動態(tài)飽和吸附量及洗脫率的考察，以確定可用于廣山楂總黃酮分離純化的最佳大孔吸附樹脂及其分離純化工藝參數(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SB-5200D超聲波清洗器(寧波新芝生物科技有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市科瑞儀器有限公司)，UV-2500分光光度計(日本島津公司)，600型三用水箱(常州澳華儀器有限公司)，RE-2000E旋轉蒸發(fā)儀(杭州億捷科技有限公司) 等。

1.2 材料及試劑 廣山楂，購于廣西藥材站，由廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授鑒定為臺灣林檎的干燥成熟果實；蘆丁對照品，購自中國藥品生物制品檢定所；AB-8大孔吸附樹脂(天津南開大學化工廠)， D101大孔吸附樹脂(天津骨膠廠)，HPD-450大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)；硝酸鋁，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，無水乙醇等其他試劑皆為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量的測定

2.1.1 標準曲線的繪制 參考文獻方法[4]，精密稱取20 mg 已于120 ℃干燥的蘆丁對照品，置于100 mL容量瓶中，加適量70%乙醇溶解后定容，即獲得蘆丁標準對照液(0.2 g/L)。分別精密移取0、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mL蘆丁對照液于25 mL容量瓶, 補充70%乙醇達6 mL，再分別加入0.75 mL亞硝酸鈉溶液(50 g/L)，搖勻后靜置6 min；再加入0.75 mL硝酸鋁溶液(100 g/L)，搖勻后靜置6 min；加入10 mL氫氧化鈉溶液(40 g/L)，以70%乙醇定容，搖勻；靜置15 min后，以第1瓶溶液為空白調(diào)零，測定各瓶溶液510 nm吸光度值；并以濃度(C)及所測吸光度值(A)進行線性回歸?；貧w方程：A=8.436 7×C-0.058；r=0.999 0。

2.1.2 樣品的測定 將不同條件所獲洗脫液定容至所要求體積，精密量取0.2 mL液體樣品，置于25 mL量瓶中，從補充70%乙醇達6 mL起按2.1.1項所述操作。測定溶液510 nm的A值，按上述回歸方程計算各樣品的總黃酮濃度，并按以下公式計算洗脫液樣品的總黃酮量及樣品的總黃酮回收率。總黃酮量(mg)=樣品體積×樣品總黃酮濃度；總黃酮回收率=洗脫液中總黃酮量/供試液中總黃酮量×100%

2.2 廣山楂總黃酮供試液的制備 精確稱取10 g廣山楂粉(經(jīng)干燥后粉碎并過40目篩)，置250 mL錐形瓶；以16倍體積的70%乙醇經(jīng)超聲輔助提取3次，每次提取時間為40 min；提取液濾過后合并，重復提取20次，合并濾液；減壓回收溶劑后，藥液以蒸餾水定容至500 mL，即獲廣山楂供試液(A)。取適量A液按2.1.2項所述操作檢測其總黃酮濃度，結果顯示A液總黃酮濃度為13.39 mg/mL。

2.3 3種大孔吸附樹脂的預處理 分別取適量備選的3種大孔吸附樹脂(HPD-450、AB-8、D101)，以95%乙醇浸泡24 h后濕法裝柱；以大量95%乙醇清洗樹脂，至流出液按1∶5與水混合時無白色混濁為止；然后改以大量蒸餾水洗柱，直至流出液無醇味。

2.4 分離純化廣山楂總黃酮最佳樹脂的篩選

2.4.1 3種待選樹脂對廣山楂總黃酮的靜態(tài)吸附—洗脫情況觀察

2.4.1.1 靜態(tài)飽和吸附情況觀察 取3個100 mL具塞錐形瓶，分別精密稱取3 g經(jīng)預處理的濕樹脂，各加入15 mL A液；3 h內(nèi)每10 min振搖錐形瓶30 s；分別于室溫靜置19、21、23、25 h時，各取0.2 mL上清液，按2.1.2項所述操作，考察3種待選吸附樹脂對廣山楂總黃酮的靜態(tài)吸附。結果靜置23 h后，3種待選樹脂對廣山楂總黃酮的靜態(tài)吸附均達到飽和。

2.4.1.2 靜態(tài)吸附—洗脫情況觀察 各精密稱取3 g經(jīng)預處理的3種濕樹脂(另各稱取3 g濕樹脂120 ℃干燥至恒重，以計算干濕樹脂的重量比)置于100 mL具塞錐形瓶中；各加入15 mL A液，3 h內(nèi)每10 min振搖30 s；室溫靜置23 h，使各樹脂達到靜態(tài)飽和吸附。濾出上清液，定容至25 mL，按2.1.2項所述操作，測定并計算各上清液的總黃酮量及各樹脂的靜態(tài)飽和吸附量。去除上清液后，將樹脂置于另一100 mL具塞錐形瓶中；加20 mL 95%乙醇，3 h 內(nèi)每10 min振搖30 s；室溫靜置23 h，取上清液，95%乙醇定容至25 mL，按2.1.2項所述操作，測定并計算各靜態(tài)洗脫液中廣山楂總黃酮量及各樹脂的靜態(tài)洗脫率。靜態(tài)飽和吸附量(mg/g干樹脂)=(A液總黃酮量-吸附后上清液總黃酮量)/干樹脂量；靜態(tài)洗脫率(%)=洗脫液總黃酮量/(A液總黃酮量-吸附后上清液總黃酮量)×100 %。結果見表1。

2.4.2 3種待選樹脂對廣山楂總黃酮的動態(tài)吸附—洗脫情況觀察 各精密稱取3 g(濕重)經(jīng)預處理的3種待選樹脂，濕法裝柱(1.5 cm×20 cm)；分別精密吸取15 mL A液，上樣后以蒸餾水洗脫至流出液無色，再以95%乙醇洗脫，分別收集上樣流出液、洗脫液；回收溶劑后均定容為25 mL，按2.1.2項所述操作，測定并計算各樹脂對廣山楂總黃酮的動態(tài)飽和吸附量及其洗脫率。動態(tài)飽和吸附量(mg)=上樣總黃酮量-上樣流出液總黃酮量；洗脫率(%)= 洗脫液總黃酮量/動態(tài)飽和吸附量×100 %。結果見表2。

2.5 AB-8型樹脂分離純化廣山楂總黃酮工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.5.1 確定最佳洗脫劑體積分數(shù) 精密稱取5份各3 g(濕重)AB-8型樹脂，濕法裝柱(1.5 cm×20 cm)；精密吸取A液各5 mL，分別上柱，以蒸餾水洗至流出液無色后，再分別以20%、30%、50%、70%、95%的乙醇洗脫，至洗脫液無色，分別收集洗脫液；回收溶劑后定容為25 mL，按2.1.2項所述進行操作，測定并計算各體積分數(shù)洗脫液中總黃酮回收率?？傸S酮回收率(%)=(洗脫液總黃酮量/上柱總黃酮量)×100%。結果見表3。

2.5.2 確定洗脫液流速 制備4根AB-8型樹脂柱(1.5 cm×20 cm，3 g濕樹脂)，分別精密吸取5 mL A液上樣；以蒸餾水洗至流出液無色后，再以70%乙醇洗脫，流速分別設定為1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min；洗脫至流出液無色后，分別收集各洗脫液；回收溶劑并定容至25 mL，按2.1.2項所述操作，測定并計算不同流速洗脫液的總黃酮回收率。結果見表3。

2.5.3 確定洗脫液用量 制備AB-8樹脂柱(1.5 cm×30 cm，10 g濕樹脂)，精密吸取15 mL A液上樣；以蒸餾水洗至流出液無色后，再用70%乙醇以1.5 mL/min 的流速洗脫；按每15 mL(1 BV)為1個流分收集洗脫液，共分別收集10流分；按2.1.2項所述操作，測定并計算各洗脫液所含總黃酮量，繪制洗脫曲線(見圖1)。

2.5.4 確定吸附—洗脫周期 按照以上篩選結果所確定的最佳純化工藝條件，精密稱取AB-8型濕樹脂10 g裝柱(1.5 cm ×30 cm)，準確吸取15 mL A液上樣；以蒸餾水洗至流出液無色后，以5倍柱體積的70%乙醇，按1.5 mL/min流速洗脫；收集洗脫液，以此做為1個吸附—洗脫周期。在同一柱子上重復9個周期，將每個周期收集的洗脫液分別回收溶劑后定容至25 mL，按2.1.2項所述進行操作，測定并計算各周期的總黃酮回收率。結果見表4。

2.6 測定經(jīng)AB-8型樹脂分離純化后的廣山楂總黃酮純度 制備AB-8型樹脂柱(1.5 cm×30 cm，10 g濕樹脂)，準確吸取15 mL A液上樣；以蒸餾水洗至流出液無色后，以5倍柱體積的70%乙醇按1.5 mL/min流速洗脫；洗脫液合并后回收溶劑，定容為25 mL；按2.1.2項所述操作，測定并計算洗脫液總黃酮量。另取洗脫液10 mL于平皿中，以60 ℃烘干至恒重，以計算所純化的廣山楂總黃酮純度。結果其純度為73.77%，RSD=0.77%(n=3)。

3 討論

山楂功可消食化積、活血化瘀，國內(nèi)常用的山楂藥材資源為薔微科山楂屬植物山里紅及山楂的干燥成熟果實[5]。常用山楂主要含有黃酮類、低聚黃烷類、有機酸類、微量元素, 另外還有含有三萜類、甾體類和有機胺類等成分[6]。近年來對山楂及山楂葉總黃酮的藥理藥效研究較多，發(fā)現(xiàn)其具有抗心肌缺血、保護血管內(nèi)皮細胞、調(diào)血脂及抗腫瘤等多種藥理作用[7～10]，應用前景非常廣泛。

廣山楂為薔薇科蘋果屬植物臺灣林檎，別名尖嘴林檎、大果山楂等，主產(chǎn)于廣西賀州、桂林、柳州、百色等地。在廣西將廣山楂作為山楂的習用品已有80多年歷史[11]，而目前對于廣山楂藥理、藥效學研究的報道還較少。有研究認為，廣山楂含有豐富的黃酮類成分[12]，可能是其活血化瘀的物質(zhì)基礎。我們在前期實驗中已確定了廣山楂總黃酮的提取工藝[13]，但如何獲得純度較高的廣山楂總黃酮仍有待研究。

大孔吸附樹脂對中藥總黃酮類成分有較好的富集作用，但不同類型的大孔吸附樹脂有不同的吸附特性。為了制備純度高的廣山楂總黃酮，我們選取了不同極性的3種型號大孔吸附樹脂(D101、AB-8、HPD-450)，通過考察各型樹脂對廣山楂總黃酮的靜態(tài)、動態(tài)吸附—洗脫情況，發(fā)現(xiàn)3種待選樹脂中，弱極性的AB-8型大孔吸附樹脂對廣山楂總黃酮的富集純化能力最佳。研究發(fā)現(xiàn)，采用AB-8型樹脂富集廣山楂總黃酮的最佳工藝條件為：采用擬純化總黃酮量10倍量以上的干樹脂，以5倍樹脂體積的70%乙醇為洗脫劑，洗脫劑流速為1.5mL/min，樹脂重復使用3次后需進行再生。以此最佳工藝條件操作，以AB-8型大孔吸附樹脂富集并純化的廣山楂總黃酮回收率可達94.09%，所獲總黃酮純度可達73.77%。此方法操作簡便、成本低、收率高，易于進行大規(guī)模生產(chǎn)。

[1] 于智峰,王敏.大孔吸附樹脂在黃酮類化合物分離中的應用[J].中藥材,2006,29(12):1380-1384.

[2] 陳洪濤,蔡丹昭,林立波.大孔吸附樹脂分離純化榕樹葉總黃酮的實驗研究[J].廣西中醫(yī)學院學報,2008,11(2):43-46.

[3] 蔡丹昭,劉華鋼,陳洪濤.大孔吸附樹脂分離純化番石榴葉總黃酮的研究[J].生命科學研究,2008,12(1):57-60.

[4] 陳洪濤,蔡丹昭,林立波.榕樹葉總黃酮超聲提取工藝條件的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(8):1955-1957.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010：372.

[6] 劉家蘭,徐曉玉.山楂的藥理作用研究進展[J].中草藥,2009,40(增刊):63-66.

[7] 閔清,白育庭,張志,等.山楂葉總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的心電圖、NO及丙二醛變化的影響[J].中國臨床藥理學與治療學,2007,12(7):800-803.

[8] 蘭文軍,葛亞坤,鄭筱祥.山楂葉總黃酮對缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞毒、一氧化氮和Ca2+水平的調(diào)控作用[J].航天醫(yī)學與醫(yī)學工程,2005,18(2):157-1601.

[9] 楊宇杰,王春民,黨曉偉,等.山楂葉總黃酮對高脂血癥大鼠血管功能損傷的保護作用[J].中草藥,2007,38(11):1687-1690.

[10] 張妍,李厚偉,孫建平,等.山楂果總黃酮的提取分離及體外抗腫瘤活性[J].中草藥,2004,35(7):787-789.

[11] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標準(1990年版)[M].南寧:廣西科學技術出版社,1992:21,22,139-141.

[12] 陳勇,甄漢深,董藝.廣山楂及其葉質(zhì)量分析研究[J].時珍國醫(yī)國藥,1999,10(7):511-513.

[13] 覃學謙,陳洪濤,劉源煥,等.廣山楂總黃酮超聲提取工藝條件研究[J].廣西中醫(yī)藥大學學報,2014,17(1):68-70.

Discussion of the optimum conditions and parameters of separation and purification of total flavones from Malus doumeri (Bois) Chev by macroreticular resin

CHENHong-tao1,LIUYuan-huan,QINXue-qian,CAIDan-zhao

(1TheAffiliatedPharmaceuticalFactoryofGuangxiUniversity,Nanning530023,China)

Objective To explore the optimum technological parameters of the separation and purification process of total flavones from Malus doumeri (Bois) Chev with macroreticular resins. Methods With the static and dynamic saturated adsorption and elution rate as index, compare the advantages of nonpolar resin D101, weak polarity resin AB-8, medium polarity resin HPD-450 used in isolation and purification of total flavones from Malus doumeri (Bois) Chev, and optimize the adsorption process parameters of selected optimum resin by investigating the total flavones recovery rate. Results The static saturated adsorption of D101, AB-8, HPD-450 were 94.802, 118.494, 98.317 mg/g dry resin, the static elution rate were 83.434%, 91.253% and 83.434% respectively; the amount of total flavones eluted were 91.490, 115.567, 98.528 mg, elution rate were 85.852%, 93.217% and 89.051% respectively. Eluted with five times resin volume of 70% ethanol, flow rate of 1.5 mL/min, the recovery rate of total flavones was 94.09%, the purity of which was 73.77%. Conclusion The comprehensive performance of AB-8 resin was the best, the optimum process parameters were that of eluted with five times resin volume of 70% ethanol and 1.5 mL/min flow rate.

total flavones of Malus doumeri (Bois) Chev; macroreticular resin; separation and purification

國家自然科學基金資助項目(81360688)；廣西自然科學基金資助項目(2012GXNSFAA239008)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥民族醫(yī)藥自籌經(jīng)費課題項目(gzzc1203)； 廣西壯族自治區(qū)教育廳廣西高等學校科研項目(201204LX195)。

陳洪濤(1973-)，學士，高級工程師，研究方向為中藥新藥開發(fā)及中藥制劑質(zhì)量控制。E-mail: 2427668099@qq.com

蔡丹昭(1972-)，副教授，博士，研究方向為中藥藥理的分子機制。E-mail: danzhaoc@sina.com.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.08.003

R284.1

A

1002-266X(2015)08-0007-04

2014-09-21)